3. Коронавирусы.

СЕМЕЙСТВО КОРОНАВИРУСОВ (CORONA VIRIDAE)

Морфология. Вирионы представляют собой частицы с диаметром от 75 до 160 нм. Они окружены «частоколом» поверхностных булавовидных выступов длиной 12—24 нм и напоминают фигуру солнечной короны. В сердцевине вириона различают центральное тело и матрикс. Центральное тело представляет собой спиральный нуклеокапсид с диаметром 14—16 нм, образованный нитями диаметром 9 нм. Матрикс расположен между ' нуклеокапсидом и липопротеидной оболочкой.

Химический состав и физико-химические свойства. В состав вирионов входят РНК, белки, липиды, углеводы. Липиды находятся в составе липопротеидной мембраны,углеводы — в составе гликопротеидов. Коэффициент седиментации вирусов 390S. Плавучая плотность вирионов в хлориде цезия 1,18 г/см3, плавучая плотность нуклеокапсида 1,31 г/см3.

Геном представляет однонитчатую линейную РНК с молекулярной массой 5 • 106—7 • 106 и коэффициентом седиментации 60—70S. При нагревании РНК диссоциирует на фрагменты с коэффициентом седиментации 35S и 4S. РНК содержит до 70 полиаденилатовых последовательностей на З'-конце. Геном коронавирусов имеет позитивную полярность, проявляет инфекционную активность.

Белки и антигены. Коронавирусы содержат три группы белков: белок нуклеокапсида, который ассоциирован с геномом и формирует спиральный РНП; белки оболочки, являющиеся гликопротеидами, которые обеспечивают адсорбцию и проникновеие вируса в клетку и обусловливают слияние вирусной и клеточной мембран; матриксный белок, находящийся в составе вирусной оболочки и в разной степени гликозилированный. Вирионы агглютинируют эритроциты кур, мышей, крыс, но не агглютинируют эритроциты человека. Нейрамини-дазной активностью вирионы не обладают и элюция вируса с эритроцитов имеет иной механизм, чем у вируса гриппа. Устойчивость к физическим и химическим факторам. Вирусы чувствительны к эфиру и детергентам, неустойчивы к рН 3,0, прогреванию при температуре 56°С, УФ-лучам.

Патогенез и клиника. Коронавирусы вызывают у человека острое респираторное заболевание, наиболее характерным симптомом которого является профузный насморк, обычно без повышения температуры. В кишечник вирус попадает вторично в результате вирусемии

Эпидемиология. Коронавирусные инфекции носят сезонный характер и распространены в основном в осенне-зимний период, однако спорадические случаи встречаются в течение всего года. Источником инфекции является больной человек, путь передачи воздушно-капельный. Заболевание высоко контагиозно, часты внутрисемейные и внутрибольничные вспышки.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования является отделяемое носоглотки, из которого вирус выделяют на органных культурах трахеи и бронхов эмбриона человека. Однако в связи с трудностью культивирования вируса основным методом является серологическая диагностика. Определение прироста антител в парных сыворотках крови больных проводят в РСК, РН в органных культурах, РТГА и РНГА. В реакциях используют эталонные диагностикумы, полученные из штаммов, адаптированных к росту в культурах ткани или обладающих гемагглютинирующей активностью (для постановки РТГА).

Профилактика не разработана.

Билет 43

1. Методы культивирования микоплазм, риккетсий, хламидий. среды, методика.

Микробиологическая диагностика туберкулеза

Возбудители туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis,

М. bovis — являются кислотоустойчивыми бактериями, характери­зующимися медленным ростом на питательных средах. Заражение происходит воздушно-капельным путем, иногда через желудочно-кишечный тракт.

Основные методы, применяемые для микробиологической диагностики туберкулеза, приведены на схеме 8.

Методические указания

Материал для исследования: мокрота, экссудат, гной, про­мывные воды бронхов, желудка, ликвор, моча. Для консер­вации и ингибиции сопутствующей микрофлоры патологи­ческий материал перед транспортировкой в лабораторию обра­батывают 10% раствором фосфата натрия.

Бактериоскопическое исследование (схема 8). Мокроту по­мещают в чашки Петри и ставят на черную поверхность. Петлей или препаровальными иглами выбирают гнойный комочек, переносят его на предметное стекло ближе к одно­му из концов и, растирая между двумя стеклами, готовят мазок. Ликвор отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина, в которой находятся микобакте­рии туберкулеза и клеточные элементы. Мочу центрифугируют

и делают мазки из осадка. Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации микобактерий туберкулеза от М. smegmatis, которые могут находиться в моче здоровых людей. В отли­чие от микобактерий туберкулеза они обесцвечиваются спиртом.

Мазки окрашивают по Цилю — Нельсену и микроскопируют, просматривая до 100 полей зрения в препарате. Микобакте­рии туберкулеза окрашиваются в ярко-красный цвет, распола­гаются поодиночке или небольшими скоплениями (см. рис. 17). Единичные бактерии можно обнаружить в препарате, если их содержание не менее 10⁵ в 1 мл мокроты. Поэтому при небольшом содержании микобактерий туберкулеза в материа­ле применяют методы «обогащения» — гомогенизации и осаждения или флотации.

Метод гомогенизации и осаждения. К суточной порции мокроты добавляют равный объем 1%раствора едкого натра (или антиформина) для гомогенизации, флакон плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10—15 мин После центрифугирования и нейтрализации кисло­той из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю — Нельсену.

Метод флотации. Мокроту гомогенизируют и прогре­вают при 55°С в течение 30 мин на водяной бане. Затем добавляют 1—2 мл ксилола, дистиллированную воду, повтор­но встряхивают в течение 10 мин и отстаивают 20 мин при комнатной температуре. На поверхности образуется пена, состоящая из всплывших капелек ксилола с адсорби­рованными микробами. Пипеткой или петлей из пенообраз­ного слоя готовят мазок, несколько раз наслаивая материал на предметное стекло по мере его высыхания. Мазок обез­жиривают эфиром, фиксируют нагреванием и окрашивают по Цилю—Нельсену.

Применение люминесцентной микроскопии повышает число находок микобактерий туберкулеза в патологическом мате­риале.

Микроскопическое исследование является ориентировочным и позволяет судить лишь о наличии кислотоустойчивых бактерий в материале без определения видовой и типовой принадлежности.

Бактериологическое исследование. Для посева используют предварительно обработанный Na₃P0₄ исследуемый материал; необработанный материал непосредственно перед посевом в течение нескольких минут подвергают действию 10% серной кислоты или 4 — 6% раствора едкого натра для освобождения от сопутствующей микрофлоры, затем тщательно встряхивают и центрифугируют. Осадок нейтрализуют и засевают на несколько пробирок со средой Левенштейна — Иенсена или другими специальными средами. Среду Левенштейна — Иенсена готовят из суспензии свежих яиц, картофельной муки, гли­церина, аспарагина, КН₂Р0₄, сульфата и цитрата магния и малахитового зеленого. Среду свертывают в наклонном положении при 85°С в течение 45 мин. Посевы инкубируют при 37°С 4 — 6 нед и более, так как микобактерии туберку­леза размножаются очень медленно, особенно в первых генерациях. Культуры этих микобактерий имеют вид серо­ватого или светло-кремового морщинистого или крошкообраз­ного сухого налета (рис. 70).

При идентификации выделенной культуры микобактерий туберкулеза и дифференциации ее от потенциально-патоген­ных микобактерий учитывают морфологические и тинкториаль- ные особенности, характер и скорость роста на питательных средах, биохимические свойства и вирулентность для лабо­раторных животных. Из биохимических свойств чаще всего определяют способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту (ниациновая проба Конно). Это один из важных признаков, с помощью которого удается отличить Mycobacterium tuberculosis, хорошо синтезирующие никотино­вую кислоту, от палочек М. bovis, образующих ее в мини­мальных количествах.

Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5% раствора хлорамина. При наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для нейтрализации KCN после учета результатов реакции в пробирке добавляют 3—5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.

Для ускорения диагностики используют метод микрокуль­тур Прайса. На нескольких предметных стеклах (ближе к од­ному концу) делают толстые мазки из исследуемого материа­ла. Мазки высушивают, обрабатывают несколько минут 2-6% серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цитратной кровью в разве­дении 1:4 — 1:8 и ставят в термостат. Через 7 — 14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по Цилю — Нельсону и микроскопируют (рис. 71) —вирулентные штампы образуют микрокультуры, имеющие вид жгутов или кос (корд-фактор).

Определение чувствительности микобактерий туберкулеза к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам проводят методом серийных разведений. С этой целью по ОД мл взвеси микобактерий туберкулеза засевают в пробирки со средой Левенштейна — Иенсена, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов первого и второ­го ряда: 5, 10, 50 мкг/мл стрептомицина; 5, 10, 50, мкг/мл ПАСК; 1, 5, 10, 25 мкг/мл тубазида; 30 мкг/мл циклосерина и этионамида. Учитывают результаты на 12 —21-й день инкубации. Клинические границы устойчивости микобактерий туберкулеза: стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК—10 мкг/мл, тубазид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл.

Биопроба. Применяется при первичной диагностике с целью выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза из органов животного, зараженного исследуемым материалом, а также для определения вирулентности этих микобактерий. Исследуемый материал обрабатывают серной кислотой для освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят подкожно в количестве 2—3 мл морской свинке с отрицательной туберкулиновой реакцией. Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и микроскопическое исследование органов и делают посевы. М. tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и малопатогенны для кроликов, М. bovis непатогенны для морских свинок и кроликов.

Микробиологическая диагностика риккетсиозов

Материалом для выделения возбудителей при всех видах риккетсиозов служит кровь, взятая у больного в возможно раннем периоде лихорадки (схема 20). Однако выделение риккетсий с диагностической целью практически не произво­дится, поскольку они размножаются только в клеточных куль­турах и куриных эмбрионах, а для выделения риккетсий Провацека приходится предварительно заражать кровью вшей

Биопроба. Применяется для дифференциации возбудителей эндемических риккетсиозов от риккетсий Провацека. Для этого самцу морской свинки внутрибрюшинно вводят кровь боль­ ного. При большинстве эндемических риккетсиозов у живот­ных развивается специфический периорхит, сопровождающийся накоплением риккетсий в мезотелии влагалищных оболочек яичка.

Для обнаружения риккетсий в переносчиках, органах зара­женных животных и клеточных культурах готовят препараты, окрашивают их по Здродовскому и микроскопируют. Рик- кетсии Провацека полиморфны. В зависимости от стадии инфекции, вида клеточной культуры различные морфологи­ческие типы риккетсий обнаруживаются в цитоплазме и ядрах зараженных клеток (рис. 82). Использование иммунофлюорес- центного метода облегчает обнаружение риккетсий.