Техника получения первично-трипсинизированных культур клеток из куриного эмбриона:
1. Обрабатывают скорлупу спиртом, йодом и снова спиртом.
2. Срезают скорлупу с тупого конца на границе воздушного мешка, удаляют подскорлупную оболочку, извлекают тело эмбриона (голову отделяют – не используется).
3. Тело эмбриона измельчают до кусочков 1-2 мм, поместив в раствор Хэнкса.
4. Переносят пастеровской пипеткой кусочки ткани в пробирки.
5. В пробирку наливают 2 мл раствора Хэнкса, дают жидкости отстояться, отсасывают (повторяют 2-3 раза для отмывания крови).
6. К отмытым кусочкам ткани добавляют 1-2 мл раствора трипсина, пипетируют (насасывание и выдувание на стенку пробирки) в течение 5 мин. Отстаивают жидкость в центифужной пробирке, наливают 3 мл гидролизата лактальбумина. К оставшимся кусочкам добавляют 1 мл раствора трипсина – повторяют операции.
7. Центрифугирование – 10 мин при 100 Об/мин.
8. Надосадочную жидкость отсасывают, осадок ресуспендируют в 5 мл лактальбумина.
9. Фильтруют через марлю.
10. Подсчет клеток в камере Горяева (считая всю камеру).
11. Суспензию клеток разводят раствором лактальбумина с сывороткой до содержания 400000 клеток в 1 мл и разливают по 1 мл в пробирки, закрывают стерильными пробками.
12. Инкубирование в термостате при 37ºС, в практически горизонтальном положении (угол 5º).
Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.
При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток.
Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками (пенициллином и стрептомицином в концентрации 500-1000 Ед/мл) или в случае с простыми вирусами - эфиром для уничтожения посторонней микрофлоры (бактерий и грибов). Допустимым считается использование специальных антибактериальных фильтров или центрифугирование материала на невысокой скорости. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.
Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может служить:
1) развитие специфической дегенерации клеток - цитопатическое действие вируса (ЦПД;
2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;
3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);
4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);
5
)
феномен бляшкообразования: монослой
зараженных вирусом клеток покрывается
тонким слоем агара с добавлением
индикатора нейтрального красного (фон
- розовый). При наличии вируса в клетках
образуются бесцветные зоны («бляшки»)
на розовом фоне агара.
По морфологическим изменениям в культуре клеток можновыделить несколько типов проявления ЦПД:
- полная дегенерация клеточного монослоя – изменения в большинстве клеток, их гибель и отделение от стекла, а отдельные живые клетки изменяют свою морфологию (пикноз ядра и цитоплазмы). Напр., вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО.
- частичная дегенерация – не характерно отслоение всех клеток от стекла.
- круглоклеточная дегенерация – образование скоплений больших округлых клеток, которые напоминают гроздья. Напр., аденовирусы.
- симпластообразование – образование многоядерных клеток (симпласты или синцитии).Напр., вирус кори, краснухи, эпидемического паротита, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус.
- пролиферативный тип изменений – вызывается онкогенными вирусами и проявляется формированием нескольких слоев клеток.
- образование внутриклеточных включений, которые могут локализоваться внутри ядра (аденовирусы) или в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри)клетки. Их образование, форма, величина наличие в них вирусных нуклеиновых кислот являются важными признаками при проведении лаб. диагностики вирусных инфекций.
