2) Проникновение вируса в клетку происходит двумя путями:

а) виропексисом (пиноцитозом);

б) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной мембраной

3) Депротеинизация вируса - освобождение генома вируса от вирусных защитных оболочек происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов. Конечными продуктами депротеинизации являются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком.

Вторая фаза включает стадии реализации вирусного генома ведущая к синтезу вирусных компонентов:

1) Транскрипция - переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по законам генетического кода.

2) Трансляция - процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот.

3) Репликация - процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологичных вирусному геному

4) Сборку, созревание вирусных частиц

5) Выход вирионов из клетки осуществляется двумя путями:

а) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка разрушается. Этот путь присущ простым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам),

б) выход из клеток путём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока не истощатся её ресурсы.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Вирусоскопический метод – заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале при помощи: световой микроскопии (с обязательным использованием специальных методов окраски, использованием протрав и импрегнации), электронной микроскопии, люминесцентной микроскопии.

Вирусологический метод – заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лаб. животное, куриный эмбрион, культура клеток, тканей, органов), индикации вируса и его последующей идентификации.

Серологический метод – применяется для выявления вирусного антигена или обнаружения специфических антител в исследуемой сыворотке. Особенность этого метода – исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при t = 4-8ºC, а вторую – через 10-14 дней. Сыворотки исследуют одномоментно! О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой (диагностическое значение имеет сероконверсия в 4 раза и выше.)

Экспресс-диагностика – использование чувствительных и надежных иммунологических методов (иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, вестерн-блотт и др.).

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются следующие биологические модели: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

I. Культуры клеток.

В зависимости от техники приготовления культуры клеток классифицируют на:

- однослойные – клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла или пластика.

- суспензионные – клетки размножаются во всем объеме питательной среды при ее перемешивании.

- органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применение ограничено).

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить в зависимости от числа жизнеспособных генераций на

1) первичные (первично трипсинизированные),

2) полуперевиваемые (диплоидные)

3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов.

По морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Чаще всего используют культуры фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, IMR-9), коров, свиней, овец и т.д.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ – сердце обезьяны цинамобус, ПЭС – почки эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – почка зеленой обезьяны и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека, КВ – карцинома ротовой полости, RD – рабдомиосаркома человека.

Культуры органов – представляют собой приготовленные в стерильных условиях срезы органов животных, которые на протяжении определенного срока (дни, недели) сохраняют свою жизнедеятельность в особенных условиях культивирования

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие.

В составе ростовых питательных сред должно содержаться большое количество питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя.

Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Они могут быть:

1) природными (сыворотка крови крупного рогатого скота, жидкости из серозных полостей, продукты гидролиза молока, различные гидролизаты – гемогидролизат, гидролизат лактальбумина, экстракты тканей)

2) синтетическими (среда 199 для культивирования первично-трипсинизированных и перевиваемых культур, среда Игла – содержит минимальный набор аминокислот и витаминов и используется для культивирования различнах линий клеток, среда Игла МЕМ – культивирование особо требовательных линий клеток).

Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса.