Методички на первый семестр / Биохим св-ва мо
.docБиохимические свойства микроорганизмов.
1. Роль ферментов в жизнедеятельности бактерий.
Все питательные вещества и любые элементы, подвергающиеся превращения в бактериальной клетке, вступают в реакции с участием ферментов.
Ферменты или энзимы – специфичные белковые катализаторы, присутствующие во всех живых клетках.
В настоящее существует несколько классификаций ферментов:
I. По механизму действия:
1. Регуляторные (аллостерические) ферменты воспринимают метаболические сигналы и в соответствии с ними изменяют свою каталитическую активность.
2. Эффекторные ферменты – подразделяются на 6 классов (по типу, катализируемой химической реакции):
а) оксидоредуктазы – перенос электронов
б) трансферазы – перенос различных химических групп
в) гидролазы – перенос функциональных групп на молекулу воды
г) лиазы – присоединение групп по двойным связям и обратные реакции
д) изомеразы - перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм
е) лигазы – образование связей С-С, С-S, C-O, C-N за счет реакций конденсации, сопряженных с распадом АТФ.
II. По условиям образования:
1. Индуцибельные – наличие в субстрата в среде вызывает синтез фермента, отвечающего за его катаболизм.
2. Конститутивные – синтезируются в независимости от условий среды.
III. По месту действия:
1. Экзоферменты – проявляют свою активность вне клетки бактерии.
2. Эндоферменты – все ферменты, катализирующие биохимические реакции внутри клетки.
IV. По химическому составу:
1. Простые – состоят только из молекулы белка
2. Сложные – кроме молекулы белка содержат также ко-фермент (например, ион металла). Если ко-фермент отсутствует – энзим не активен!
Определение ферментативной активности бактерий играет огромную роль в их идентификации, т.к. способность синтезировать определенные ферменты является генетически детерминированным, стабильным признаком бактерий.
Чаще всего изучают сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образование ферментов декарбоксилаз, оксидаз, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы, фибринолизина, преобразование нитратов в нитриты. Для этого разработаны специальные питательные среды – пестрый ряд Гиса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.
2. Практическое использование ферментов микробного происхождения.
Получение микробных ферментов – важнейшая отрасль промышленной микробиологии. Например, для улучшения пищеварения применяют готовые препараты ферменты – амилазы, целлюлазы, протеазы, липазы, облегчающих соответственно гидролиз крахмала, целлюлозы, белка и липидов. При изготовлении сладостей для предупреждения кристаллизации сахарозы применяют инвертазу дрожжей, для осветления фруктовых соков – пектиназу. Коллагеназа клостридий и стрептокиназа стрептококков, гидролизующую белки, способствуют заживлению ран и ожогов. Литические ферменты бактерий, секретируемые в окружающую среду, действуют на клеточные стенки патогенных микроорганизмов и служат эффективным средством в борьбе с последними, даже если они обладают множественной устойчивостью к антибиотикам. В качестве инструментария в биоорганической химии, генной инженерии и генотерапии используют выделенные из бактерий рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, полимеразы, ДНК-лигазы и прочие ферменты, направленно модифицирующие нуклеиновые кислоты.
|
Биохимическая активность |
Название питательной среды |
Характер изменений под воздействием бактериальной культуры |
|
|
Протеолитическая (расщепление белков) |
Молоко |
Растворение сгустка казеина |
|
|
Среда с желатиной |
Разрежение (посев уколом в столбик питательной среды) |
||
|
Пептолитическая (расщепление пептонов – продуктов неполного гидролиза белка) |
МПБ |
Определяют образование NH3 (индикатор – лакмусовая бумага - синеет), H2S (бумага пропитанная ацетатом свинца - чернеет), индола (бумага пропитанная 12% щавелевой кислотой - розовая) |
|
|
Пептонная вода |
|||
|
Сахаролитические (расщепление сахаров) |
Среда Гисса (1% пептонная вода + 0,5% натрий хлорид + 1% углевода (глюкоза, лактоза, мальноза, манит, сахароза) + индикатор) |
Изменение цвета индикатора, входящего в состав питательной среды при образовании конечных продуктов ферментации сахаров – кислот; появление пузырьков в толще среды свидетельствует об образовании газа |
|
|
Дифференциально-диагностические среды для выявления ферментации лактозы |
Среда Эндо (агар+лактоза+фуксин, обесцвеченный сельфатом натрия) |
Лактозоположительные колонии – темно-красные с металлическим блеском (E.coli), лактозоотрицательные – бесцветные (сальмонеллы). |
|
|
Среда Плоскирева (агар с солями желчных кислот + лактоза + цитрат натрия + гипосульфит натрия _ кальцинированная сода + йод + нейтральный красный + бриллиантовый зеленый) |
Лактозоположительные колонии – розовые, лактозоотрицательные колонии - бесцветные |
||
|
Среда Левина (МПА + лактоза + однозамещенный фосфат калия + метиленовый синий + эозин) |
Стерильная среда – фиолетовая. Лактозоположительные колинии – темно-синие, лактозоотрицательные – розовые. |
||
|
Среда Ресселя (полужидкий агар+ 1% лактоза + 1% глюкоза + индикатор ВР – смесь водного голубого и розоловой кислоты) Разливают так, чтобы образовался столбик агара и скошенная поверхность. |
Если ферментируют: 1. лактозу и глюкозу – изменение цвета (при подкислении) во всей среда на синий. 2. только глюкозу – изменение цвета столбика среды.. 3. газообразование – появление пузырьков или разрыв среды. |
||
|
Гемолитические (определение продукции ферментов патогенности – гемолизинов) |
Кровяной агар (агар + 5-10% дефебринированной или свежей крови барана или кролика) |
Способны продуцировать гемолизины – в среде вокруг колоний образуются зоны просветления на матовом фоне. По цвету гемолиза определяют тип гемолизинов (α – зеленоватый, β - бесцветный, γ – без видимых изменений) |
|
|
Липолитические |
Введение в питательные среды липидов или жироподобных субстанций – твинов. |
Положительный результат – радужные венчики вокруг колоний. |
|
|
Редуцирующая способность |
Введение в состав питательных сред красителей |
Фиксируя время изменения индикатора, судят о выраженности редуцирующей способности. |
|
|
Декарбоксилазная |
Введение в состав питательных сред аминокислот (лизина, орнитина, глютаминовой кислоты и др.) |
Изменение цвета инфикатора |
|
|
Плазмокоагулазная |
Цитратная плазма кролика |
Образование фибринового сгустка |
|
|
Лецитовителазная (лецининазная, вителазная) |
Желточно-солевой агар или агар Чистовича (синонимы) |
Вокруг колоний зона помутнения с характерным радужным венчиком по периферии |
|
|
ДНК-азная |
Введение в состав сред ДНК (после инкубации бактерий такие среды заливают на 7-10 мин 1N HCl) |
HCl взаимодействует с ДНК, образуя непрозрачный белый преципитат. ДНК-аза деполимеризует ДНК и при добавлении HCl вокруг колоний образуется прозрачная зона |
|