Асимметричность
3'А |
|
Матричная цепь |
||
Ц |
А |
Г Т Т |
Г А А |
|
У |
Г |
У |
Ц А А |
Ц У У |
5' |
Смысловая цепь |
|
5'
ДНК
ДНК
3'
Общие параметры транскрипции
•Скорость – около 30 нуклеотидов / сек
•Частота ошибок – 1 на 104 нуклеотидов, т.е. на пять порядков выше, чем при репликации.
•Синтез РНК – гораздо менее точный процесс, чем синтез ДНК.
Транскрипция генов в хромосоме
3' |
Р |
Ген 1 |
Р Ген 2 |
|
ДНК
5' |
Ген 3 Р |
•Одна хромосома – одна молекула ДНК
–около тысячи генов
•Матричной может быть любая из цепей.
•Но в одном гене матричная цепь всегда одна и та же – та, на которой промотор.
5'
3'
РНК-полимераза
Чтобы доказать возможность синтеза РНК на ДНК-матрице нужно было обнаружить фермент, участвующий в таком синтезе. К 1959 г. выделили такой фермент – РНК-полимеразу. Работает сходно с ДНК-полимеразой, но с рибонуклеозидтрифосфатами (NTP). РНК-полимераза в отличие от ДНК-полимеразы не нуждается в праймерах. Синтез РНК на ДНК- матрице так же сопровождается высвобождением пирофосфата
NTP - субстрат для фермента, катализирующего полимеризацию NMP, причем фосфодиэфирное связывание в направлении 5’- 3’.
Каждый шаг транскрипции состоит в добавлении одного NMP к растущей полирибонуклеотидной цепи
Хорошо изучена структура РНК-полимеразы E coli. Молекула фермента из 4 субъединиц, молекулярный вес активной формы около 500000 Да, две (бета) субъединицы определяют каталитическую способность, одна (сигма) –регуляторную, включая инициацию транскрипции. У эукариот – 3 различные РНК-полимеразы, из гораздо большего числа субъединиц.
Промоторы, связывание с ДНК-матрицей и -субъединица
В результате транскрипции синтезируется одноцепочечная РНК, комплементарная фрагменту одной из цепей двойной спирали ДНК. Транскрибируемая цепь ДНК – матричная, комплементарная ей – партнерская или смысловая.
У прокариот, подобных E. coli, σ (sigma) субъединица RNA polymerase связывается с районом promoter на ДНК.
Первый шаг транскрипции – связывание РНК-полимеразы с матрицей. Такие сайты
связывания впервые обнаружены у бактерий, где -субъединица РНК-полимеразы узнает специфичные последовательности ДНК, называемые промоторами. Они
локализованы в 5’ области, левее от точки начала транскрипции гена.
Промоторы разных генов слегка отличаются.
Есть сильные и слабые промоторы.
От промоторов зависит эффективность транскрипции. У бактерий есть сильные и слабые промоторы, что влияет на скорость инициации – от 1 в 1-2 сек до 1 за 10-20 мин.
Мутации в области промоторов могут сильно снизить экспрессию генов.
Механизм связывания РНК- полимеразы с промоторами очень важен, поскольку от него зависит транскрипция.
Важны два понятия 1) консенсусные последовательности ДНК – гомологичные
различным генам одного организма или же одному или нескольким генам родственных видов. Они эволюционно консервативны и играют большую роль в биологических процессах. В бактериальных промоторах найдены 2 консенсусные последовательности ТАТААТ, локализованная на 10 нуклеотидов левее сайта инициации транскрипции (область -10 или блок Прибнова или бокс Прибнова) и ТТГАГА – на 35 нуклеотидов левее сайта инициации транскрипции (область -35). Мутации в обеих последовательностях – существенное уменьшение транскрипции. Консенсусные последовательности
большинства эукариотических генов сравнимы с областью -10, или ТАТА-боксом (из-за обогащенности Т и А).
2) степень связывания РНК-полимеразы с различными промоторами сильно варьирует. Это приводит к неодинаковой экспрессии различных генов и связана с вариабельностью последовательностей в области промотора
Инициация транскрипции и элонгация РНК
РНК-полимераза катализирует введение молекул рибонуклеозид трифосфата в направлении 5 'к 3‘, связывающихся фосфодиэфирными связями, формируя антипараллельный ДНК/РНК дуплекс. Праймер не требуется для инициирования процесса.
После инициации, σ (сигма) субъединица отделяется от холофермента, и продолжается удлинение цепи под руководством корового фермента, пока он в конце концов не сталкивается с последовательностью терминации.