Неклеточный синтез белков

Внеклеточной системе сборки аминокислот в полипептиды должны содержаться необходимые для синтеза белков факторы – рибосомы, тРНК, аминокислоты и другие компоненты, участвующие в трансляции + иРНК – матрица для трансляции

В1961г. иРНК еще не была выделена из клеток, но с помощью

полинуклеотид фосфорилазы синтезировали искусственную РНК, которую затем добавляли in vitro

Вотличие от РНК-полимеразы полинуклеотид фосфорилаза не нуждается в ДНК-матрице и добавляет рибонуклеотиды к растущей цепи случайным образом (соответственно их концентрации в смеси).

Вероятность встраивания определенного рибонуклеотида пропорциональна его доступности для фермента по сравнению с другими рибонуклеотидами

В качестве первого шага в расшифровке генетического кода были использованы короткие искусственные последовательности гомополимеров мРНК UUUUUU ..., AAAAAA ..., или CCCCCC в качестве матрицы для синтеза полипептидов с использованием радиоактивно меченых аминокислот.

Было обнаружено, что Poly U определяет включение 14С-фенилаланина, указывая, что кодон фенилаланина - UUU.

На матрице полиG прямого синтеза не получилось

Смесь кополимеров

Далее синтез гетерополимеров из двух и более рибонуклеотидфосфатов в разных соотношениях.

Предполагалось, что на основании относительных пропорций каждого рибонуклеозид фосфата можно прогнозировать частоту отдельных кодонов в синтетической РНК.

Если такую РНК затем ввести в систему, то можно определить долю каждой аминокислоты в синтезированном белке и состав триплетов, кодирующих специфичные аминокислоты

Расчет частоты возможных кодонов, полученных с использованием

гетерополимерной смеси в соотношении 1A: 5C.

Существует вероятность 1/6 для А и 5/6 - для C, чтобы занять каждую позицию в триплете.

Изучив процент аминокислот, включенных в синтезированный белок, можно предложить вероятный состав оснований для некоторых кодонов.

Пролин появляется в 69% случаев, поэтому он может кодироваться CCC

(57,9%) и одним кодоном, состоящем из 2C: 1A (11,6%).

Гистидин, (14%), вероятно, кодируется одним 2C: 1A (11,6%) и одним 1С: 2А (2,3%).

Треонин, (12%), скорее всего кодируется только одним 2C: 1А. Аспарагин и глутамин каждый, по- видимому, кодируются одним из 1С: 2A кодонов, и лизин - AAA.

Метод связывания триплетов

1964 г. – Ниренберг и Ледер предложили новый метод связывания триплетов, который помог установить точные последовательности кодонов

В присутствии молекул РНК рибосомы связываются с последовательностями РНК длиной 3 рибонуклеотида и формируют комплекс, напоминающий комплекс in vivo

Эти триплеты – кодоны иРНК комплементарны последовательностям тРНК, называемых антикодонами

Можно было получить заданную последовательность триплетов – специфическое связывание тРНК, несущей аминокислоту (аминоацил- тРНК) с триплетом РНК в комплексе иРНК-рибосома.

Аминокислоту метили – можно проследить какой из триплетов иРНК связывается с антикодоном

Инкубация меченой аминоацил-тРНК с синтезированными триплетами РНК и рибосомами на фильтре, задерживающем только крупные рибосомные комплексы.

При связывании меченой тРНК с триплетами иРНК на рибосомах метка оставалась на фильтре – соответствие тестируемой аминокислоты и данного триплета.

Так установили специфичные для каждой аминокислоты кодоны. В некоторых случаях добиться необходимого соответствия не удалось.

Было проверено 50 из 64 триплетов и получены два вывода

– одной аминокислоте соответствует несколько триплетов и один триплет кодирует только одну аминокислоту.

Анализ связывания триплетов.

Рибосомы могут связывать трехрибонуклеотидные последовательности (кодоны) in vitro, которые в свою очередь связываются с комплементарным антикодоном тРНК, переносящим специфичную радиоактивно меченную аминокислоту.

Весь комплекс может быть ассоциирован на нитроцеллюлозном фильтре и проанализирован по меченым аминокислотам.

Около 50 из 64 кодонов были установлены с использованием анализа связывания триплетов.

Повторяющиеся кополимеры

Метод Кораны – синтез протяженных молекул РНК с заданной последовательностью, повторяемой несколько раз.

Например, последовательность из динуклеотидных повторов с двумя чередующимися триплетами – тринуклеотидные повторы образуют 3 потенциальных триплета, тетрануклеотидные – 4.

При добавлении таких синтетических иРНК в систему синтеза белков в синтезированных полипротеинах содержались теоретически ожидаемые пропорции аминокислот.

Корана (Nobel 1968) разработал методику для синтеза длинных молекул РНК, состоящих из коротких последовательностей (ди-, три-и тетрануклеотидов), повторяющихся много раз. Эти повторяющиеся кополимеры дают предсказуемые комбинации потенциальных кодонов.