Тест Эймса подвергает ауксотрофные штаммы сальмонеллы (his–)

воздействию химических соединений, чтобы оценить их мутагенность.

Экстракт печени добавляют, так как метаболические изменения этих соединений в печени может сделать их мутагенными.

Мутагенность химических веществ находит свое отражение в частоте обратных мутаций, которые дают прототрофы дикого типа (his+).

Исправление повреждений ДНК: системы репарации

Фотореактивная репарация у прокариот

При исследовании мутагенности УФ было обнаружено множество типов репарации повреждений ДНК.

В 1949 г. А. Кельнер открыл репарацию индуцированных ультрафиолетом нуклеотидных сшивок – фотореактивацию.

Повреждения ДНК, индуцированные у E. coli УФ, можно частично восстановить, если после облучения поместить бактерии под синий свет. Фотореактивная реакция зависит от температуры, т.е. это ферментативная реакция.

Позднее показано, что репарация зависит от активности фермента –

фермента фотореактивации (PRE). Этот фермент расщепляет ковалентные связи между остатками Т в тиминовых димерах и восстанавливает структуру ДНК. Для активации молекулы фермента требуется фотон, но затем свет не нужен. Клетки E. coli могут обойтись без этого фермента, поскольку нуль-мутация в гене, кодирующем этот фермент, не летальна.

У человека и других эукариот такой системы фотореактивации нет.

Фотореактивная

репарация.

В E. coli фермент фотореактивации (PRE) может расщеплять связи между тиминовыми димерами, заряжаясь от фотона синего света.

Реакция обратна действию УФ-излучения на ДНК.

Эксцизионная репарация у прокариот и эукариот

В 60-е годы у прокариот обнаружена и другая зависимая от света

система репарации повреждений ДНК. В основе ее лежит механизм эксцизионной репарации, который у прокариот и эукариот включает

три основных этапа:

1)нуклеаза узнает и вырезает ошибочное основание или измененную структуру ДНК. Такая эксцизия затрагивает одно основание или нуклеотид или несколько нуклеотидов, смежных с ошибочным. В спирали ДНК остается брешь.

2)ДНК-полимераза I заполняет эту брешь дезоксирибонуклеотидами, комплементарными нуклеотидам в неповрежденной цепи ДНК, которые пристраиваются с 3’-ОН конца.

3)ДНК-лигаза сшивает последний разрез цепи, который остается на 3’-ОН конце последней пары оснований, и закрывает брешь.

Известно два типа эксцизионной репарации – репарация оснований и репарация нуклеотидов.

При эксцизионной репарации оснований исправляются повреждения азотистых оснований, вызванные спонтанным гидролизом или химическими агентами. Первый этап такой репарации в клетках E. coli включает узнавание химически модифицированные основания ДНК- гликозилазами, специфичными для разных повреждений ДНК. Эти ферменты расщепляют связь между основанием и сахаром, и появляется апиримидиновый сайт (АР-сайт), который узнается АР- эндонуклеазой. Эндонуклеаза разрезает цепь ДНК в АР-сайте, а разрез узнается ферментами эксцизионной репарации, исправляющим это повреждение.

С помощью эксцизионной репарации нуклеотидов исправляются блоки ошибок, изменяющие структуру двойной спирали, например пиримидиновые сшивки.

Репарация ошибок репликации

Для исправления ошибок репликации ДНК существуют другие системы репарации. Функцию коррекции таких ошибок выполняет ДНК-полимераза III. В процессе полимеризации ДНК в молекулу могут встраиваться некомплементарные нуклеотиды, которые распознают и вырезают из цепи ДНК ферментным комплексом, а затем неправильный нуклеотид замещается комплементарным. У бактерий коррекция ошибок повышает точность синтеза ДНК на два порядка – первоначально некомплементарные нуклеотиды встречаются с частотой 10-5, после коррекции – с частотой не более 10-7.

Для исправления ошибок оставшихся после коррекции существует дополнительный механизм репарации ошибок спаривания. При повреждениях ДНК или неправильном спаривании оснований эти ошибки должны узнаваться, а неправильный нуклеотид или нуклеотиды удаляться и замещаться комплементарными.