Картирование генов у бактерий и бактериофагов

В 1943 г. С.Луриа и М.Дельбрюк – доказательства возможности спонтанных мутаций у бактерий по аналогии с эукариотами. Их тест заложил основы современной генетики бактерий, где спонтанные мутации – основной источник генетической изменчивости бактериальных клеток.

Случайно возникающие мутантные клетки можно выделить из культуры и размножить с помощью селективных сред для последующего анализа новой мутации. Поскольку бактерии и вирусы обычно гаплоидны, все возникающие мутации обнаруживаются непосредственно у потомков мутантной клетки.

Минимальная среда для роста бактерий – глюкоза или лактоза, и соли Na, K, Mg, Ca, NH4.

Растущие на минимальной среде и способные синтезировать все необходимые метаболиты бактерии – прототрофы, если не все (из- за мутации) – ауксотрофы. Последние обозначают, например, his-,

прототрофные - his+ (по синтезу гистидина)

Генетическая рекомбинация у бактерий: конъюгация

В 1946 г. Дж.Ледерберг и Э.Татум обнаружили конъюгацию – процесс передачи генов от одной бактериальной клетки к другой, сопровождающийся генной рекомбинацией Это позволило разработать методы хромосомного картирования по аналогии с кроссинговером в мейозе.

Генетическая рекомбинация у бактерий и бактериофагов приводит к замещению одного или нескольких генов одного штамма генами из

клеток другого штамма. У эукариот рекомбинация происходит в результате кроссинговера и реципрокного обмена гомологичными

участками хромосом. В итоге оба этих процесса приводят к переносу генов с одной хромосомы на другую и изменениям в генотипе.

Ледерберг и Татум работали с различными ауксотрофными штаммами E coli K12. Для штамма А – метионин и биотин, для штамма В – треонин, лейцин и тиамин.

Сначала клетки штаммов выращивали раздельно на полных средах, затем смешивали и высевали на минимальную среду. Выросшие колонии – прототрофы, образовавшиеся в результате рекомбинаций между штаммами, поскольку вероятность обратных спонтанных мутаций сразу в нескольких генах у исходных штаммов крайне мала.

Прототрофные клетки возникали с частотой 1/107, в контрольных опытах с высевом клеток исходных штаммов, а не смеси, прототрофов не обнаружили.

Ауксотроф A нуждается в метионине (met) и биотине (bio) для роста; ауксотроф B в треонине (thr), лейцине (leu) и тиамине (thi); обоим требуется дополненная среда. Ледерберг and Татум (Nobel 1958) смешали два штамма и высеяли их на минимальную среду и восстановили прототрофы дикого типа, показав наличие

рекомбинации.

Бактерии F+ и F- - типа

Перенос генетического материала происходит только в одном направлении. У E coli обнаружены два половых типа: F+ (доноры) и F- (реципиенты). Реципиент получает от донора часть ДНК, которая встраивается в ее хромосому.

Б.Дэвис показал, что для передачи генов необходим тесный контакт двух клеток. F+ и F- клетки росли в одной среде, но разделенные стеклянным фильтром, препятствующим смешиванию бактерий, но не среды. В этом случае прототрофы не образовывались. Сейчас известно, что контакт клеток происходит в самом начале конъюгации и заканчивается передачей F фактора или полового фактора

Этот фактор содержат именно F+ клетки. При определенных условиях F фактор может элиминироваться из фертильных клеток, но при совместном культивировании с F+ клетками они вновь становятся фертильными

Если клетки F+ и F-

растут в U-образной трубке Дэвиса,

которая позволяет смешивание среды,

но не клеток,

прототрофы не обнаруживаются.

Таким образом, физический контакт

необходим для

конъюгации и

генетической

рекомбинации.

Было предположено, что F фактор – это мобильный генетический элемент. Позже было показано, что после конъюгации и генетической рекомбинации этот фактор несут все клетки-реципиенты, т.е. реципиентам передается F фактор в виде самореплицирующейся ДНК.

Клетки E coli могут содержать несколько генетических элементов, способных к саморепликации и существующих отдельно от бактериальной хромосомы, либо встроенных в хромосому.

Это кольцевые молекулы ДНК размером от тысячи пар нуклеотидов до трети длины бактериальной хромосомы, равной 3.2 х 106 п.н.

Анализ структуры выделенного из бактерий F фактора – это кольцевая двуцепочечная ДНК, занимает около 2% длины бактериальной хромосомы. Такие

самореплицирующиеся молекулы (репликоны) называют

плазмидами или эписомами.

F фактор или эписома содержит кроме других генов 19 генов, продукты которых участвуют в переносе генетической информации в клетки-реципиенты.

Некоторые из этих генов кодируют белки пилей – структур, напоминающих трубочки, которые расположены на поверхности F+ клеток

Считается, что перенос F фактора во время конъюгации бактерий включает образование цитоплазматического мостика – конъюгационной трубки между клетками и репликацию кольцевой ДНК F фактора таким образом, что надрезанный эндонуклеазой одноцепочечный конец ДНК проникает в F- клетку и там синтезируется комплементарная цепь. В результате у обеих клеток есть F фактор.

1.В клетках F+, две цепи двойной спирали фактора фертильности

(F) (плазмида) разделяются.

2.Одна из двух цепей перемещается в клетку-реципиент (F-).

3.Другая цепь остается в клетке-донореl.

4.Обе цепи реплицируют с вращением по часовой стрелке по кругу.

5.Обе клетки – донор и реципиент становятся F+ после конъюгации.