Подходы к физическому картированию: картирование «сверху вниз» и «снизу вверх»
Контиг (контига) - группа перекрывающихся клонов, охватывающих протяженный участок генома
Существуют два основных метода секвенирования химический и
ферментативный, применяется в настоящее время преимущественно второй – метод Сэнгера.
Используется примесь дидезоксинуклеотидов - ddNTP (у них нет OH-группы у 3’-атома углерода), которая добавлялась к обычным дезоксинуклеотидам. И при синтезе ДНК in vitro это приводит к прекращению синтеза цепи в позиции, в которой вставился ddNTP. Через позицию 3’ идет присоединение нуклеотида к строящейся молекуле ДНК. Но если на 3`- конце не будет гидроксильной группы, а будет водород, то синтез дальше не пойдет – он будет терминирован.
Это используется следующим образом. У нас есть матрица (нить ДНК), которую надо секвенировать. Если идет синтез, и в первой позиции матрицы стоит А, то может встроиться обычный Т и синтез пойдет дальше, а может встроиться ddТTP и синтез дальше не пойдет. Произойдет обрыв цепи, а полученный синтезированный фрагмент займет при фракционировании определенную позицию согласно своему размеру. Следующий обрыв будет соответствовать второй букве секвенируемой нити, и также займет свою позицию согласно длине при фракционировании на электрофорезе и т.д. И так по каждому нуклеотиду. Так мы восстановим последовательность нуклеотидов в секвенируемой нити ДНК.
Рис. 3,10 Чтение последовательности ДНК.
(а) радиоавтограф части геля с сиквенсом, и
(б) отслеживание радиоавтографа. Каждая полоса соответствует реакции, содержащей один из четырех ddNTPs используемых методику секвенирования ДНК обрывом цепи. Последовательность считывается с нижней части геля, каждый последующий фрагмент на один нуклеотид больше, чем предыдущий. Несколько сотен оснований можно прочитать на хорошем радиоавтографе, хотя могут быть и неясные участки и, следовательно, их необходимо переделать. Обычно любой кусок ДНК секвенируется несколько раз для получения наилучших из возможных результатов.
