Но дело в том, что в ДНК нуклеотиды расположены не случайно, и это является проблемой для восстановления последовательности из перекрывания отрезков. Если две последовательности из 1000 нуклеотидов перекрываются на 20 нуклеотидов или сто – это еще ничего не значит, так как весь этот фрагмент из 1000 нуклеотидов может быть несколько раз повторен в геноме. Поэтому нужно было сначала расставить вдоль генома фрагменты, а уже потом выявлять их перекрывание на основе сиквенса.
Как это можно было сделать? Нужно было поставить какие-нибудь «метки» в геноме человека, какой участок стоит за каким. Последовательность таких участков и составляет карту генома. Первой такой картой стала карта генетическая. Рядом показана окрашенная хромосома, на которой видны поперечные полоски. Поперечная окрашенность индивидуальна для каждой хромосомы, каждая полоска имеет собственный номер, который представляет собой "адрес" данного участка на хромосоме. Ясно, что в каждом таком участке миллионы пар нуклеотидов, последовательность которых мы должны определить. Были получены полиморфные маркеры, то есть найдены такие участки хромосомы, которые у разных людей (или на разных хромосомах одного человека) содержат неидентичные последовательности нуклеотидов. Для генетической карты с интервалом в 10% рекомбинации нужно 300 равноудаленных маркеров. Эти маркеры нужны для различения одной хромосомы от другой в данном локусе.
Полиморфизм ДНК. Основные типы генетических маркеров
Полиморфизм - существование более чем одного варианта последовательности ДНК (гена, маркера) с частотой, превышающей частоту обратного мутирования. (на практике >1%)
В основе детекции ДНК маркеров лежит метод амплификации (размножения) фрагментов ДНК in vitro с точностью до нуклеотида методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР). Для различения родительских хромосом использовали так называемые STR-маркеры (Short
Tandem Repeat), состоящие из одинаковых звеньев, чаще всего звено состояло из пары нуклеотидов ЦА, т.е. нашли места в геноме, где повторялись эти вкрапленные звенья.
Описанный подход применяется не только в фундаментальных исследованиях , но и в практике идентификации личности при судебно-медицинской экспертизе. Допустим данный локус в хромосоме может находиться в одном из 10 альтернативных состояний. (Эти состояния, аллели, различимы по их электрофоретической подвижности). Эти состояния различают 10 хромосом или людей с такими хромосомами. Если мы возьмем в анализ еще один локус (на другой хромосоме) с такими же характеристиками, то по этому локусу мы тоже различим 10 хромосом или людей. А по сочетанию состояний в этих двух локусах различимы 10х10=102 хромосом. Пять таких локусов позволят различить 105 хромосом. А поскольку хромосом у каждого из нас по паре, то сочетания аллелей этих пяти локусов дают 105 х105 = 1010 вариантов. Это число вариантов больше, чем число людей на земле. На практике при идентификации используют набор аллелей из 13 локусов, хотя и пяти может быть вполне достаточно.
Генетическая карта была первой картой генома человека, на основе которой строилась дальнейшая работа по картированию. Эту карту соотнесли с физической картой, показывающей порядок следования клонированных фрагментов ДНК вдоль генома
Физические карты генома часто представлены наборами фрагментов ДНК, клонированные в векторных молекулах (рекомбинантных ДНК), упорядоченно расположенных относительно друг друга. Такой набор непрерывно перекрывающихся фрагментов ДНК называется контиг.
Для того чтобы выявить перекрывание клонированных фрагментов ДНК и понадобилась ранее установленная карта генетических маркеров.
Существуют две стратегии для секвенирования больших участков ДНК.
(а) направленный подход, где относительное положение клонированных фрагментов известно. Это подход использует данные от физических карт, чтобы клоны были сопоставлены с определенными частями хромосомы. Расширяя этот подход в сторону уменьшения размеров клонированных фрагментов (а в конечном итоге можно достичь размера последовательности), последовательность данных может быть собрана как множество упорядоченных последовательностей фрагментов. Такой подход иногда называют методом «клон за клоном» или clone contig .
(б) случайный подход – «метод дробовика» - нет попытки определить относительный позиционный порядок последовательности фрагментов. Вместо этого фрагменты генерируется и секвенируются случайным образом, итоговая последовательность может быть собрана сочетанием перекрывающихся участках последовательности.
Два подхода имеют свои достоинства; направленный подход является более трудным на этапе клонирования и секвенирования, но монтаж последовательности немного проще, чем в методе дробовика.
