Разрезание

Сверху на нитроцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечивая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и связывается с нитроцеллюлозным фильтром.

После прогревания фильтра при 80оС в вакууме ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченой ДНК.

Основные проблемы, возникающие при генетических манипуляциях, заключаются в следующем:

1)гены при трансформации, попадая в чужеродную среду, подвергаются воздействию протеаз, поэтому их надо защищать;

2)как правило, продукт чужого гена аккумулируется в клетках и не выделяется в среду;

3)большинство желаемых признаков кодируется не одним, а группой генов. Все это существенно затрудняет перенос и требует разработки технологии последовательной трансплантации каждого гена.

Развитие техники рекомбинантных ДНК позволяет проводить выделение генов эукариот и экспрессировать их в гетерологических системах. В настоящее время методы генетической инженерии позволяют конструировать генетические системы, способные функционировать в клетках прокариот и эукариот.

Сейчас разработаны системы клонирования в различных бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Наибольший интерес с практической точки зрения представляют системы клонирования в грамположительных бактериях, многие из которых являются промышленно используемыми, а также в дрожжах и клетках высших организмов.

Разделы геномики:

структурная геномика – содержание и организация геномной информации;

функциональная геномика – реализация информации, записанной в геноме, от гена – к признаку;

сравнительная геномика – сравнительные исследования содержания и организации геномов разных организмов;

Итог структурной геномики – получение последовательности нуклеотидов (сиквенса sequence), которая представляла бы полностью каждую из хромосом с первого нуклеотида до последнего.

Для того, чтобы получить такой сиквенс, сегодня приходится определять последовательность нуклеотидов в достаточно коротких отрезках ДНК, длиной примерно 1000 позиций. В геноме человека 3 миллиарда позиций, значит, его надо разбить на куски, которые и будут «читаться». Затем нужно восстановить единую последовательность нуклеотидов из сравнения отдельных прочтенных отрезков текста. Восстановление основано на сравнении определенных последовательностей и выявлении в них перекрывающихся (идентичных) участков текста. Длина участка перекрывания должна превышать длину последовательности, которая может встретиться в данном геноме по причинам случайного характера.

Например, в геноме человека 3*109 п.н. случайно может встретится последовательность длиной 15 нуклеотидов – поскольку в каждой позиции может находится один из четырех нуклеотидов, то вероятность того, что заданные нуклеотиды окажутся в 15 позициях подряд 415 =230 что примерно равно 109. То есть в отрезке длиной 109 позиций заданная 15-нуклеотидная последовательность может встретиться 1 раз по причинам случайного характера.