Скрининг и отбор рекомбинантных клеток.
После переноса сконструированных ДНК, как правило, лишь
небольшая часть реципиентных клеток приобретает необходимый ген. Поэтому очень важный этап – идентификация клеток,
несущих ген-мишень.
На первой стадии идентифицируют и отбирают клетки, несущие вектор, на основе которого осуществлен перенос ДНК. Отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости.
На второй стадии отбирают клетки, несущие вектор и ген- мишень. Для этого используют две группы методов:
1)основанные на непосредственном анализе ДНК клеток- реципиентов и
2)основанные на идентификации признака, кодируемого геном-мишенью.
Скрининг библиотеки ДНК
Скрининг библиотеки - поиск нужного клона (фрагмента ДНК)
Зонд - одноцепочечная молекула ДНК или РНК с определенной последовательностью оснований, несущая метку (радиоактивную, флуоресцентную, иммунологическую)
•гомологичные гены (участки ДНК) близких видов
•гены того же генного семейства
•искусственно синтезированные молекулы ДНК
1.Посев культуры клеток на чашку Петри и наращивание
2.Перенос ДНК из клонов на фильтр и денатурация ДНК
3-4. Гибридизация с зондом и выявление метки
5.Пересев нужного клона с чашки Петри в среду
6.Наращивание клона со вставкой в бактериальных клетках
7.Вырезание вставки из
рекомбинантного вектора с помощью рестриктазы
8. Анализ искомого фрагмента ДНК (секвенирование, поиск мутаций и т.д.)
Иногда известно только приблизительное расположение гена на хромосоме. Зная последовательность генов, расположенных по
соседству, можно определить локализацию искомого гена, используя метод «прогулки по хромосоме». Ген, соседний с исследуемым,
выделяют из библиотеки, и короткие ДНК-фрагменты, соответствующие концевым последовательностям этого гена, используют в качестве зондов для обнаружения клонов с комплементарными этим фрагментам последовательностями. Затем проводят анализ степени перекрывания и переходят к следующему зонду
Хромосомная |
1’ 1 |
2’ 2 |
3’ 3 |
|
ДНК |
||||
|
|
|
||
Исходный клон |
1’ 1 |
|
|
1-ый шаг - выделение рекомбинантных клонов а - г
2-ой шаг - выделение рекомбинантных клонов д - ж
и т.д.
1’ 1 |
а |
|
1’ |
1 |
б |
1’ |
1 |
в |
|
1 |
2’ 2 г |
2 
3’ 3 д 
2’ 2 
е
2’ 2 ж
Схема «хромосомной ходьбы»
Заполнение пробелов: «прогулка по хромосоме»
1.С помощью зонда на 5’- маркер находят фрагмент в геномной библиотеке
2.С помощью зонда на 3’-конец клонированного фрагмента последовательно находят перекрывающиеся фрагмент («соседний клон»)
3.Прогулку по хромосоме продолжают, пока не найден фрагмент, содержащий 3’- фланкирующий маркер
Характеристика клонированных последовательностей
Построение рестрикционной карты по сайтам рестриктаз
EcoRI и BamHI
Клонированные линейные фрагменты ДНК длиной 5 т.п.н.
Разрезание рестриктазами и электрофорез в агарозном геле
Длинные _ фрагменты
Короткие + фрагменты
|
Маркер |
|
|
Контроль |
|
EcoRI |
|
BamHI |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
BamHI
EcoRI+
т.п.н.
5.0
4.5
3.0
2.5
2.0
0.5
Размеры фрагментов
Построение |
т.п.н.) |
|
|
|
кривой по длине |
|
|
|
|
калибровочной |
|
|
|
|
маркерных |
(в |
|
|
|
фрагментов и |
фрагментовДлина |
|
|
|
определение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
длины |
|
|
|
|
анализируемых |
|
|
|
|
фрагментов |
|
|
|
|
Построение |
|
|
Длина пробега |
|
|
|
|
|
|
рестрикционной |
|
|
|
|
карты |
|
|
|
|
Непорезанная |
|
5 т.п.н. |
|
|
|
|
|
||
ДНК |
|
|
|
|
|
0.5 т.п.н. |
4.5 т.п.н. |
|
|
|
EcoRI |
|
|
|
|
BamHI |
|
3 т.п.н. |
2 т.п.н. |
|
|
|
|
|
|
EcoRI |
BamHI |
||
Окончательная 0.5 т.п.н. |
2.5 т.п.н. |
2 т.п.н. |
||
рестрикционная |
|
|
|
|
карта |
0 |
0.5 |
3.0 |
5.0 |
|
||||
Блоттинг (блот-гибридизация) нуклеиновых кислот
