Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплементарная мРНК (кДНК). Полученная комплементарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплементарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов. Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина).
Обратная
трансляция.
Аминокислотная
последовательность может быть "обратно транслирована" в вырожденные последовательности ДНК, которые могут быть запрограммированы в ДНК-синтезаторе для создания набора олигонуклеотидов, которые должны включать один, присутствующий в реальной геномной ДНК.
Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена.
Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора.
Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-реципиент, встроить ее в геном,
позволить идентификацию трансформированных клеток, обеспечить стабильную экспрессию введенного гена.
Существует несколько типов векторов: бактериальные плазмиды, вирусы, бактериофаги, гибридные вектора, содержащие ДНК фага и плазмиды (космиды и фазмиды), транспозоны, искусственные хромосомы. Основное различие – в длине встраиваемого фрагмента чужеродной ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro с
изолированными ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции, которые расщепляют вектор в одном участке, превращая его из кольцевой формы в линейную с образованием липких концов, комплементарных концам вводимой ДНК. Комплементарные концы вектора и вводимого гена сшиваются лигазой. Полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы замыкают с образованием кольцевой молекулы.
Плазмида pBR322
Отбор рекомбинантных векторов
Плазмида pBR322 - популярный вектор для клонирования.
- два гена устойчивости к антибиотикам (ампициллину и тетрациклину) -три одиночных сайта рестрикции (сайта для клонирования):
EcoRI (в некодирующей части) PstI (в гене Amp-r)
SalI (в гене Tet-r)
Рекомбинантные плазмиды со вставкой по EcoRI устойчивы к Amp и Tet
по PstI - устойчивы к Tet, чувствительны к Amp по SalI - устойчивы к Amp, чувствительны к Tet
