Метод рекомбинантных ДНК

Генетическая инженерия или техника рекомбинантных ДНК - это совокупность приемов, позволяющих путем операций in vitro перенести генетический материал из одного организма (источника генов) в другой (хозяин или реципиент) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме.

Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим.

В 1972 г. была создана первая рекомбинантная молекула ДНК, состоящая из фрагмента ДНК вируса SV40 и бактериофага λ с опероном E. coli. Инструментом для генетического

конструирования стали две группы ферментов –

рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) и лигазы. Первые необходимы для получения однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестриктазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение всех генноинженерных манипуляций.

Общий принцип генной инженерии.

Общая схема молекулярного клонирования:

-получение нужного гена;

-встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);

-введение гена, входящего в состав вектора, в организм- реципиент;

-идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.

Получение генов.

Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.

Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–8 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить внутри узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые тупые концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие. Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплементарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.