Доказательства гомогенности белка
Цель
анализа конечного продукта, полученного
в результате очистки, заключается в
том, чтобы выяснить, содержит ли он один
или большее число белков, и обнаружить
в нем примеси, даже если они присутствуют
в очень малых количествах. Так
гель-электрофорез позволяет выявить
1% примеси.
1.
Электрофорез как в нативных, так и в
денатурирующих условиях, является
методом №1 для доказательства гомогенности
белка.
2.
Определение молекулярной массы с помощью
масс-спектрометрии.
3.
Метод изоэлектрофокусирования.
4.
Ультрацентрифугирование используется
при анализе липопротеинов или других,
связанных с мембранами белков. В опытах
по седиментации хорошо разделяются
компоненты с различными коэффициентами
седиментации. Небольшие количества
примеси детектируются по отклонению
экспериментальных данных от теоретической
прямой зависимости между логарифмом
концентрации и квадратом расстояния
от седиментирующей частицы до оси
вращения.
5.
О гомогенности препарата можно судить
по данным N-концевого анализа, при
условии, что N-концевая аминокислота не
заблокирована и нет примесных белков
с идентичной N-концевой аминокислотой.
6.
Аминокислотный состав может дать
сведения о гетерогенности препарата,
если точно известны количества двух
или более аминокислот и молекулярная
масса белка. Например, количества
тирозина и триптофана можно определить
спектрофотометрически. Если молярное
содержание этих аминокислот нельзя
выразить простым отношением (к примеру,
оно составляет 5:6, а получают 5,2:6,5), то в
препарате присутствует примесь.
7.
Кристаллизация. Использование
кристаллизации как критерия гомогенности
не является однозначным. Выделение
гомогенного белка завершено и можно
приступить к его характеристике.
ВОПРОСЫ:
Назовите
методы очистки белков.
Перечислите
диапазон применимости каждого.
Назовите
преимущества и недостатки имеющихся
методов.
Опишите
особенности абсорбционной хроматографии.
Опишите
особенности афинной хроматографии.
Опишите
принцип метода
изоэлектрического фокусирования.
29
