Выбор ионообменника
Можно привести примеры выбора ионообменника для очистки белка с известной изоэлектрической точкой. Предполагается, что белок стабилен при рН 5,5-8,5.
Имеется
в виду, что при значениях рН буфера ниже
изоэлектрической, белок имеет положительный
заряд и адсорбируется на катионообменнике
и наоборот.
Элюция адсорбированного белка
Теоретически существуют два способа элюции белков. 1) Изменение рН буфера до величины, при которой связывание белка с адсорбентом ослабевает; для анионообменников используют более низкие значения рН, а для катионообменников - более высокие. 2) Повышение ионной силы, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом. На практике метод 1 не всегда дает хорошие результаты из-за буферных свойств самих белков, а в некоторых случаях и адсорбента. Более распространенные способы элюции - солевые градиенты (ступенчатые и линейные). Обычно используют хлориды калия или натрия, линейный градиент создают при помощи простого смесителя, работающего на принципе сообщающихся сосудов. При повышении концентрации соли белки начинают двигаться вниз, но перемещаются с меньшей скоростью, чем соль, поэтому каждая часть белковой зоны испытывает действие повышенной концентрации соли. Это приводит к тому, что зоны сужаются.
Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективнаяжидкостная хроматография(ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственныхвеществ), в клиническойбиохимии(при определении биологически активныхвеществв физиологическихжидкостях), в биотехнологических процессах и производствах и других областях: они позволяют определятьвеществав нано-, пико- и фемтаграммных количествах.
Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основанааффинная хроматографияна принципе избирательного взаимодействиябелков(или другихмакромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) наносителеспецифическимивеществами–лигандами, которыми могут бытьсубстратыиликоферменты(когда выделяют какой-либофермент),антигены(илиантитела),гормоныилирецепторыи т. д. Благодаря высокойспецифичностибелковк иммобилизованномулиганду, связанному сносителем(которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либобелокиз смеси. Снятие с колонки этогобелкаосуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюентадетергентов, ослабляющих связи междубелкамиилигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданныйбелокили другойбиополимервысокой степени чистоты. При помощиаффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препаратыаминоацил-тРНК-синтетазна полиакрилгидразидагаровомгеле, к которому в качествелигандовбыли присоединены определенныетРНК(транспортные РНК).
Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белковот примесей, широко используют методмолекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработкеэпихлоргидриномполисахаридадекстрана образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых вводеи называемых сефадексами. Благодаря большому сродству кводезерна сильно набухают в водной среде с образованиемгеля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделениевеществэтим методом основано на том, что большиемолекулыне проникают во внутреннюю водную фазугеля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшиемолекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появлениявеществв вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:
где V – объем элюирующей жидкостивеществас данным К, мл; V0 – свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя(вне зеренгеля), мл; Vi – объем растворителявнутригеля, мл; K – коэффициент распределения для растворенноговеществамеждурастворителемвнутри зеренгеляи окружающимрастворителем. Если анализируемуюпробу, содержащую одно растворенноевеществос К = 1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второевеществопоявится в элюирующейжидкостисразу после выхода из колонки V0 , а первое – только после выхода объема V0+ Vi.
Поскольку молекулыбелков, обладающие большимимолекулярной массойи размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки V0, в то время как все остальные вещества(включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V0+ К • Vi.
Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белкис разноймолекулярной массой.
Рис. 1.5. Гель-хроматография на колонке с сефадексом (схема).
Большие светлые кружкис крестиками - зерна сефадекса; малые черные и красныекружкии треугольники -белкис различноймолекулярной массой; А - колонка в начале работы; Б, В, Г - колонка в различные периоды времени. На графике элюции четко видно разделение белковых компонентов.
Электрофорез.Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности)белковв электрическом поле, которая определяется величиной зарядабелкапри определенных значениях рН иионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение получили методы зональногоэлектрофорезабелковна различныхносителях, в частности на твердых поддерживающих средах:геляхкрахмалаиполиакриламида,целлюлозе. Преимущества их по сравнению с методом свободногоэлектрофорезасостоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результатедиффузиии конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количествобелка(подробно эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практических руководствах побиохимии).
Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков(как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. discontinuous – прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидномгеле, при котором используютпарыбуферных растворовс различными значениями рН и разной степенипористостигель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если приэлектрофорезебелковсыворотки кровичеловека набумагеоткрываются всего 6 фракций, то приэлектрофорезев крахмальномгеле– 10, а в полиакрил-амидномгеле– до 18 разных белковых фракций.
Для выявления белковприэлектрофорезевгеляхих обрабатывают одним из следующихкрасителей: бромфеноловым синим, амидо черным 10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др. Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каждой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем прямого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять методыэлектрофорезабелковс градиентомконцентрациигеля, что значительно повышает разрешающую способность, особенно прифракционировании белковс высокоймолекулярной массой, превышающей 50000– 100000.
Весьма перспективными методами разделениябелков(как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты методаизоэлектрического фокусирования – изотахофореза, основанные на проведенииэлектрофорезав поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом рН. Точное местоположение на колонке каждогобелкаиз смеси определяется значением егоизоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновыхкислот(амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.
В последние годы широкое распространение для фракционирования белковполучили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидномгеле– методы двухмерногоэлектрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций.
Очистка белков от низкомолекулярных примесей
Применение в определенной последовательности ряда методик позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых мешающих примесей солей. Для полной очистки белков от низкомолекулярных соединений в настоящее время используют методы диализа, распределительной хроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации.
При диализе применяют полупроницаемые мембраны, диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через неё в окружающую среду. Низкомолекулярные вещества удаляются из образца и замещаются буфером. Традиционным является способ диализа через целлофановую пленку. В продаже имеются диализные трубки различного диаметра, обычно они не пропускают молекулы крупнее 15 000-20 000 Да. Для более полного удаления низкомолекулярных веществ в процессе диализа необходима смена буферного раствора в диализате. Диализ является длительной процедурой, ставят его обычно на ночь.
Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры.
Метод ультрафильтрации основан на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.
ДИАЛИЗ
Диализ — освобождение растворов высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощи полупроницаемой мембраны, т. е. перегородки. Диализ известен нам как "избирательная диффузия". Диффузия - это перемещение веществ от высокой концентрации к более низкой сквозь полупроницаемую мембрану. Избирательная диффузия - это диффузия, в процессе которой, в зависимости от мембраны, некоторые вещества будут проникать сквозь мембрану, а некоторые - нет. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через мембрану, а неспособные диализировать (проходить через мембрану) частицы остаются за ней. Простейший диализатор представляет собой мешочек из полупроницаемого материала, в котором находится диализируемая (очищаемая) жидкость. Вместо мешочка часто используют цилиндрический сосуд с полупроницаемой мембраной вместо дна. Мембраны делают из коллодия, целлофана, животных и растительных перепонок, синтетических материалов и др. Мешочек погружают в растворитель, например в воду. Постепенно концентрации низкомолекулярного вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа обычно крайне низка (недели). В основе диализа лежат процессы диффузии, и поэтому он идёт очень медленно. Диализ ускоряется с увеличением отношения площади мембран к объёму диализируемой жидкости, с повышением температуры, перемешиванием, созданием разницы в давлениях по разные стороны мембраны, частой или непрерывной сменой растворителя, в который переходят (диффундируют) через мембрану ионы или молекулы низкомолекулярного вещества.
Диализ применяют для устранения из растворов белка и ДНК нежелательных низкомолекулярных примесей или замены состава этих растворов.
Молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе
Его также применяют для очистки коллоидных растворов от примесей электролитов и низкомолекулярных неэлектролитов. Диализ применяют в промышленности для очистки различных веществ, например в производстве искусственных волокон, при изготовлении лекарственных веществ.
Материал, прошедший через мембрану, называется диализат.
Диализ в электрическом поле — электродиализ — в десятки раз ускоряет очистку диализуемых систем от электролитов. Простой электродиализатор состоит из трёх камер, отделённых одна от другой мембранами. В среднюю камеру заливают очищаемую жидкость, в боковых проточных камерах расположены электроды, погруженные в растворитель. Ионы в постоянном электрическом поле направленно перемещаются к соответствующим электродам, проникая при этом сквозь мембраны из средней камеры в боковые. Особенно эффективен электродиализ с применением ионитовых мембран, изготовленных из ионообменных материалов. Мембраны в зависимости от знака электрического заряда на их поверхности пропускают преимущественно или катионы, или анионы. Многокамерные электродиализаторы с ионитовыми мембранами применяют в гидрометаллургии и атомной промышленности (для очистки сбросных вод, концентрирования растворов солей, разделения близких по свойствам элементов), при обессоливании морской воды. Диализ и электродиализ находят применение во многих технологических процессах, в физико-химических и биологических исследованиях, а также в медицине. Метод диализа, получивший название вивидиффузии, в 1913 был использован американским учёным Абелем для изучения составных частей крови живого организма. Кровь животного проходила из артерии в вену через коллодиевые трубки, помещённые в стеклянный цилиндр, заполненный физиологическим раствором. Аппарат Абеля явился основой конструкции искусственной почки, с помощью которой проводят гемодиализ. В 1938 году впервые для гемодиализа был применен целлофан, который в последующие годы длительное время оставался основным сырьем для производства полупроницаемых мембран.
Ультрафильтрация (от ультра... и фильтрация), продавливание жидкости через полупроницаемую мембрану — проницаемую для малых молекул и ионов, но непроницаемую для макромолекул и коллоидных частиц. Вода и малые молекулы проходят через мембрану, а по другую сторону мембраны остается концентрированный раствор белка. Это достигается в специальных ячейках (объемом до 1 л) с перемешиванием раствора и с применением сжатого инертного газа. Этот же принцип лежит в основе ультрафильтрации на полых волокнах, используемых для концентрирования больших объемов растворов.
Ультрафильтрацию растворов, содержащих молекулы высокомолекулярных соединений, иногда называют молекулярной фильтрацией. Ультрафильтрацию можно рассматривать как диализ под давлением или как обратный осмос, если мембрана пропускает только молекулы растворителя. В последнем случае процесс часто называют гиперфильтрацией; при его осуществлении внешнее давление должно превышать осмотическое давление раствора.
Мембраны для ультрафильтров, обычно в виде пластин (листов) или цилиндрических патронов («свечей»), изготавливают из микропористых неорганических материалов, продуктов животного происхождения, но чаще из искусственных и синтетических полимеров (эфиров целлюлозы, полиамидов и др.). Максимальный размер проходящих через мембрану частиц (молекул) лежит в пределах от нескольких мкм до сотых долей мкм. Разделяющая способность (селективность) мембран зависит от их структуры и физико-химических свойств, а также от давления, температуры, состава фильтруемой жидкости и прочих внешних факторов.
Ультрафильтрация как метод концентрирования, очистки и фракционирования высокодисперсных систем и многокомпонентных растворов широко применяется в лабораторной практике, медицине, промышленности. Так, посредством ультрафильтрации очищают от ионных и не ионных примесей воду, органические растворители, жидкие топлива и масла; разделяют сложные смеси белков, алкалоидов и др. веществ; выделяют ферменты, витамины, вирусы; стерилизуют жидкости медицинского и фармацевтического назначения.
Типичные примеры применения ультрафильтрации: - концентрирование и очистка растворов белков, аминокислот; - удаление солей из препаратов РНК и ДНК; - удаление праймеров из ПЦР амплипированных ДНК; - удаление ферментов из препаратов ДНК перед клонированием; - удаление меченых аминокислот и нуклеотидов; - удаление белка из образцов; - подготовка образцов для ВЭЖХ; - очистка антител и гормонов из биологических жидкостей и ферментационных бульонов.
Гемодиализ - метод внепочечного очищения крови при острой и хронической почечной недостаточности. Во время гемодиализа происходит удаление из организма токсических продуктов обмена веществ, нормализация нарушений водного и электролитного балансов.
Гемодиализ осуществляют обменным переливанием крови (одновременное массивное кровопускание с переливанием такого же количества донорской крови), обмыванием брюшины солевым раствором (перитонеальный диализ), промыванием слизистой оболочки кишечника умеренно гипертоническими растворами (кишечный диализ). Наиболее эффективным методом гемодиализа является применение аппарата искусственная почка.
Проблема очищения крови занимала медицинскую науку еще с античных времен. В древности считалось, что многие болезни происходят от смешения телесных жидкостей. Для их очистки применялись различные отвары и смеси растений и минералов. Данные действия были в массе своей не эффективны или даже вредны для больного. Интерес к очищению крови то вспыхивал, то угасал.
На качественно новый уровень проблема очищения крови вышла в начале XIX века, когда с развитием биохимии стали понятны многие процессы, протекающие в организме человека. Физические основы гемодиализа заложил в 1854 году шотландский ученый Томас Грэхэм, опубликовав свой труд «Осмотическая сила». В этой работе он впервые описал способ изготовления полупроницаемых мембран из специально обработанного пергамента. С помощью данного метода стало возможно осуществлять разделение коллоидных и кристаллоидных растворов. В своей работе он экспериментально доказал классические в настоящее время законы диффузии и осмоса. Процесс диффузии кристаллоидных растворов через пергаментную бумагу был назван им «диализом». В своей работе он также доказал связь размеров молекулы и скорости диффузии. Чем молекула больше, тем меньше скорость диффузии. Спустя 50 лет Джон Джекоб Абель создал первый аппарат для удаления растворённых в крови веществ. Исследования проводились на собаках с удаленными почками. В ходе опытов была доказана возможность эффективного удаления из крови не связанных с белками азотистых соединений. Малая площадь фильтрующей мембраны у аппарата не позволяла эффективно применять его для очистки крови у людей. В качестве средства, предотвращающего свёртывание крови при прохождении через аппарат, использовался гирудин — антикоагулянт, получаемый из пиявок. В связи с низкой эффективностью препарата, серьёзную проблему представляли тромбоэмболические осложнения.
Первый гемодиализ человеку (пациенту, страдающему уремией) был проведен в Германии врачом Георгом Хаасом, в октябре 1924 года. В качестве антикоагулянта использовался очищенный гирудин, антигенные свойства которого не позволяли проводить диализ более 30-60 минут. В 1927 году впервые при гемодиализе в качестве антикоагулянта был применён гепарин. Таким образом Хаас был первым, кто свёл вместе все составляющие, необходимые для успешного гемодиализа. Он применил эффективный и безопасный антикоагулянт, создал аппарат с мембраной большой площади, обеспечил эффективную подачу крови на фильтрующую мембрану.
Первый случай успешного выведения человека из уремической комы с помощью гемодиализа произошёл 3 сентября 1945 года. Голландский медик Виллем Кольф, внедряя в клиническую практику гемодиализ, усовершенствовал аппарат, разработанный Георгом Хаасом. Основной целью, с которой применялся гемодиализ, была борьба с уремией. В результате очистки крови с помощью гемодиализатора удалось снизить концентрацию мочевины в крови и вывести больную из комы. В результате проведённого лечения, 11 сентября 1945 года было достигнуто значительное улучшение состояния пациентки, устранена угроза жизни. Впервые на практике была однозначно доказана клиническая эффективность данного метода. В 1946 году Вильям Кольф издал первое в мире руководство по лечению больных уремией с помощью гемодиализа.
Началом эпохи хронического гемодиализа считается 1960 год, когда Белдингу Скрибнеру и Вейну Квинтону удалось решить проблему долгосрочного сосудистого доступа. 10 апреля 1960 в Чикаго было объявлено о новом устройстве. Долговременный сосудистый доступ обеспечивался путем имплантации в лучевую артерию и подкожную вену двух тонкостенных тефлоновых трубок. Наружные концы шунта соединялись изогнутой тефлоновой трубкой, которая на время проведения гемодиализа удалялась, а к шунтам подключался гемодиализатор.
Метод кристаллизации белковоснован на достижении критической точки началаосаждениябелкаизрастворасульфата аммонияпри медленном повышениитемпературы. Уже получены сотни кристаллическихбелков. Однако не всякий кристаллическийбелокявляется гомогенным, поскольку при одной и той жеконцентрациирастворасульфата аммониямогут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разныебелки.
Наилучшие результаты при освобождении белковот низкомолекулярных примесей получают с помощью гель-хроматографии иультрафильтрации.
В биохимических журналах результаты очистки ферментов принято представлять в форме таблицы.
На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в виде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая и т.д.), то эти данные с большой долей вероятности могут свидетельствовать об однородности исследуемого белка.
В основе иммунохимического метода контроля гомогенности исследуемого белка лежит реакция преципитации его с соответствующей антисывороткой, полученной от иммунизированных этим белком животных. Для строгого доказательства гомогенности белка требуется одновременное использование нескольких методов.
Не потерял своего значения и метод кристаллизации белков с использованием сульфата аммония, а также метод определения растворимости белка. Последний, предложенный еще Д. Нортропом , основан на правиле фаз Гиббса, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. Метод может быть выполнен сравнительно легко и быстро в микромасштабах. Обычно определяют растворимость увеличивающегося количества исследуемого белка при постоянном количестве растворителя.