Хроматография.

Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способностипигментов(или любых других окрашенных и неокрашенныхвеществ) специфически связываться садсорбентом, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых веществи ихконцентрированиев строго определенном слоеадсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силыадсорбциии выносят с токомраствораиндивидуальныевещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белковиз смеси оказалась колоночнаяхроматографияс гидроксилапатитом, различнымиионообменными смоламии производными целллюлозы в качественосителей. При выделении и очисткебелковиспользуют четыре основных типахроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них.Хроматографияшироко применяется не только длявыделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганическихвеществ, входящих в состав живыхорганизмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качествеадсорбентовиспользуют активированныйдревесный уголь,гельфосфата кальция,оксиды алюминияиликремния.Адсорбентв видесуспензиисрастворителем(чаще всегобуферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объемерастворителянаносят на колонку – компоненты разделяемой смеси адсорбируются наадсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения –десорбциикомпонентов из колонки, применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

Рис. 1.3. Абсорбционная хроматография (схема). Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью.

1 - нанесение образца на колонку; 2 -середина опыта; 3 - окончание опыта.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажныйкрахмалилисиликагель. Образец растворяют в подходящемрастворителе, затем наносят на колонку; разделяемыевещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органическогорастворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракциипробы, содержащие одновещество, соединяют для выделения этоговеществав чистом виде.

Разновидностью распределительной хроматографииявляетсяхроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделенияпептидов,аминокислоти другихвеществ(рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служитвода, адсорбированная целлюлозными цепямифильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концомбумагупогружают в подходящую смесь органическихрастворителей(например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При движениирастворителяпобумагеблагодаря силекапиллярностипроисходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемыхвеществопределяют химическими или физико-химическими методами.

Рис. 1.4. Хроматография на бумаге(схема).

А – восходящая хроматография; Б – нисходящаяхроматография(вид сбоку); В – хроматограмма с разделенными и окрашеннымивеществами: 1 – фронтрастворителя, 2 – разделенныевещества, 3 – место нанесения образца.

Ионообменная хроматография.Ионообменные смолыявляются полимернымиорганическими соединениями, содержащимифункциональные группы, способные вовлекаться вионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленныеорганическими основаниямииаминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- иликарбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производныеполистиролаицеллюлозы, несущиефункциональные группы:

Аналогичные функциональные группысодержат триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами(производныевинилбензолаилидивинилбензола) икарбоксиметилцеллюлозой, имеющими следующиефункциональные группы:

В зависимости от заряда разделяемых белковиспользуют подходящуюионообменную смолу, сфункциональными группамикоторой обменивается и задерживается на колонке частьбелков, в то время как другиебелкибеспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонкебелкиснимают с колонки, применяя более концентрированные солевыерастворыили изменяя рН элюента.