Разложение спектра поглощения смеси на составляющие

При спектральных исследованиях часто возникает необходимость разложить спектральную кривую поглощения, представляющую собой сумму спектров поглощения двух или более компонентов, на составляющие.

В качестве примера рассмотрим смесь, состоящую из двух веществ А и В. Для того, чтобы разложить спектр поглощения этой смеси на отдельные составляющие, необходимо измерить три спектра поглощения: спектр исследуемой смеси и спектры стандартных растворов (растворов с известной концентрацией) каждого вещества в отдельности.

Отношение оптической плотности данного компонента в смеси к его оптической плотности в стандартном растворе при любой длине волны есть величина постоянная. Для веществ А и В:

К_A = D_A^1 / D_Aст^1 = D_A^2 / D_Aст^2 = D_A^i / D_Acт^i;(12)

К_B = D_B^1 / D_Bст^1 = D_B^2 / D_Bст^2 = D_B^i / D_Bcт^i. (13)

Из приведенных выше уравнений видно, что спектр поглощения вещества А в смеси можно получить, перемножив при всех длинах волн оптическую плотность вещества А в стандартном растворе на коэффициент К_A. Точно так же можно найти спектр поглощения вещества В в смеси. Задача сводится к определению этих коэффициентов.

Вследствие аддитивности оптических плотностей для смеси веществ А и В:

D^1 = D_A^1 + D_B^1 = К_A D_Aст^1 + К_B D_Bст^1,(14)

D^2 = D_A^2 + D_B^2 = К_A D_Aст^2 + К_B D_Bст^2.(15)

Решение этой системы уравнений дает следующие выражения для коэффициентов А и В:

D^1 D_Bст^2 - D^2 D_Bст^1

K_A = -------------------------------------- , (16)

D_Aст^1 D_Bст^2 - D_Aст^2 D_Bст^1

D^2 D_Aст^1 - D^1 D_Aст^2

K_B = ---------------------------------------- . (17)

D_Aст^1 D_Bст^2 - D_Aст^2 D_Bст^1

При сложении полученных спектров поглощения веществ А и В в смеси (т. е. при сложении оптических плотностей при каждой длине волны) должна получиться кривая, совпадающая с измеренным спектром поглощения смеси. Расхождение между этими кривыми будет указывать на то, что в смеси присутствует более чем два поглощающих компонента, либо говорить о наличии взаимодействия между компонентами, составляющими смесь.

Спектрофотометрический анализ биологических объектов

Для исследования физико-химических свойств биологических объектов широко используют различные спектральные методы, в том числе и абсорбционную спектрофотометрию. Регистрируемые при этом спектральные параметры поглощения (положение полос поглощения, их полуширина, соотношение амплитуд максимумов и т.д.) дают информацию о качественном и количественном соотношении компонентов биологической системы, их состоянии и структурной организации.

Однако в некоторых случаях исследуемый объект состоит из частиц, образующих скорее суспензию, чем раствор (например, суспензии клеток, клеточных органелл и т.д.). Это приводит к тому, что кроме поглощения света в изучаемом образце может наблюдаться его рассеяние. Под светорассеянием в данном случае понимается отклонение квантов измерительного пучка света, проходящего через образец, от их первоначального направления распространения. В результате этого на фотоэлемент, расположенный за объектом, попадает меньше света, что в свою очередь приводит к завышению измеряемой оптической плотности. Кроме того, если исследуемая суспензия довольно "густая", то светорассеяние может быть многократным, т.е. после рассеяния кванта света на одной частице может произойти его рассеяние на второй, третьей частице и т.д. Это приводит к увеличению фактической длины оптического пути луча света, проходящего через образец, в результате чего оптическая плотность рассеивающего объекта также повышается.

В общем случае светорассеяние сказывается на форме спектров поглощения следующим образом: 1) потеря части светового потока приводит к общему подъему спектральной кривой; 2) подъем кривой часто более значителен в коротковолновой областивследствие увеличения светорассеяния с уменьшением длины волны; 3) увеличение оптической плотности более выражено в минимумах поглощения, поэтому сглаживаются различия между минимумами и максимумами.

Вещества, поглощающие свет в биологических системах, обычно не распределены равномерно по всему объёму, а сосредоточены в клеточных структурах: хлоропластах, митохондриях и т. д. Часть лучей, пронизывая поглощающие частицы, сильно ослабляется, тогда как другая часть лучей "проскакивает" через толщу образца без поглощения. Это так называемый эффект "сита" (или "проскока"). Эффект «сита» приводит к тому, что в интенсивных максимумах поглощения оптическая плотность становится меньше, чем оптическая плотность хромофора той же концентрации.

Способы уменьшения светорассеяния объекта.

Поскольку при проведении качественного и количественного анализа биологического объекта с помощью спектральных измерений исследователя интересует, как правило, только истинное поглощение, то необходимо стремиться уменьшить влияние светорассеяния или уметь оценить его. Существует много способов, позволяющих уменьшить или учесть светорассеяние объекта. Наиболее распространенными из них являются следующие.

1. Рассеяние света в биологическом объекте (гомогенаты органов и тканей, суспензии мембран, клеток и т.д.) связано с различиями в показателях преломления среды (обычно водносолевые растворы) и рассеивающих частиц. Добавление к среде веществ, увеличивающих показатель преломления среды (глицерин, сахароза, белок и т.п.) приводит к уменьшению разницы в коэффициентах преломления и, следовательно, к уменьшению светорассеяния в объекте.

2. В некоторых случаях для борьбы с эффектом светорассеяния используют светорассеивающие пластинки. Эти пластинки, обычно изготовленные из матового стекла, обладают гораздо большей способностью к светорассеянию, чем сам объект. Светорассеивающие пластинки располагают сразу за кюветами, которые максимально приближают к фотодетектору. Перерассеивая свет, выходящий из объекта, рассеивающая пластинка фактически нивелирует разницу между мутным и прозрачным образцами. Таким образом, интенсивность регистрируемого фотодетектором света будет мало зависеть от того, рассеивает объект свет или нет, а будет определяться в первую очередь способностью объекта поглощать свет.

3. Наиболее эффективный способ устранения влияния светорассеяния на измеряемые спектры поглощения состоит в использовании спектрофотометров, снабженных так называемыми камерами мутности, примером которых может служить интегрирующая сфера Ульбрихта. В этом случае объект помещают в сферу, внутренняя поверхность которой покрыта веществом с высоким коэффициентом отражения (например, окисью магния). Пропущенный и рассеянный объектом свет многократно отражается от стенок сферы и затем через специальное окно в сфере попадает на светоприемник. Использование сферы Ульбрихта позволяет собрать большую часть рассеянного света, поэтому измеряемая оптическая плотность будет обусловлена только истинным поглощением.

4. К сожалению, далеко не все выпускаемые промышленностью спектрофотометры, особенно работающие в ультрафиолетовой области спектра, имеют камеры мутности. Однако в наиболее простых случаях обычное разбавление объекта (это позволяет перейти от многократного рассеяния к однократному) и приближение его к фотодетектору позволяет в значительной степени уменьшить влияние светорассеяния.

5. Если в эксперименте не удается использовать спектрофотометры, снабженные камерами мутности для автоматического учета влияния светорассеяния, а другие способы его устранения по каким-либо причинам оказываются не эффективными, то в таких случаях вводят поправки на светорассеяние, основанные на полуэмпирических формулах. Расчет поправок на светорассеяние дает хорошие результаты при работе с наиболее простыми оптически однородными системами, например, при изучении поглощения коллоидных растворов белков, нуклеиновых кислот, при измерении спектров поглощения суспензий клеток, биологических мембран и т.д.