Спектральные свойства ароматических кислот:

Решить задачи.

Задача 1. Оптическая плотность раствора, содержащего вещество с молярной массой М=423 в концентрации с = 32 мкг/мл, составляет 0,27 при длине волны λ =540 нм в кювете толщиной 1 см. Найти молярную концентрацию с [моль/л] и коэффициент молярного поглощения ε_λ для данного вещества.

Задача 2. Оптическая плотность раствора, содержащего вещество с молярной массой М=384 в концентрации с = 28 мкг/мл, составляет 0,27 при длине волны λ= 540 нм в кювете длиной 2 см. Найти молярную концентрацию и коэффициент молярного поглощения ε_λ для данного вещества.

Задача 3. Имеется раствор аминокислоты триптофана, оптическая плотность

которого при длине волны 280 нм составляет 0.5, и раствор тирозина, оптическая плотность которого для той же длины волны – 0.36. Какова оптическая плотность раствора той же толщины, если смешали по 1 мл каждого раствора? Считать, что молекулы этих веществ не взаимодействуют друг с другом.

Указание: при смешивании концентрация каждого вещества уменьшается в 2 раза, а оптические плотности складываются.

Основные принципы качественного и количественного спектрофотометрического анализа биомолекул качественный и количественный спектрофотометрический анализ Биомолекул

Качественный спектрофотометрический анализ.

Качественный анализ вещества предполагает, во-первых, молекулярный анализ – обнаружение в веществе определённых молекул, во-вторых, структурный анализ – обнаружение отдельных структурных фрагментов и определение их взаимного расположения.

Качественный спектрофотометрический анализ основан на том, что каждое соединение имеет характерный для него спектр поглощения. Положение и интенсивность полос поглощения вещества определяется содержащимися в нём хромофорными группами.

Определить неизвестное вещество по его спектру поглощения можно двумя способами:

. Определить спектр поглощения вещества и, сопоставив его с известным спектром поглощения по каталогу, идентифицировать вещество.

II. Определить характеристические полосы и по ним определить функциональные группы, входящие в состав молекулы вещества.

Для отождествления измеренного спектра поглощения со спектром какого-либо вещества определяют следующие параметры:

1) количество максимумов в спектре поглощения;

2) спектральное положение максимумов ( _max ) полос поглощения;

3) полуширину полос поглощения ( _1/2 ) - разность между двумя длинами волн, при которых оптическая плотность составляет половину от максимальной;

4) амплитуду максимумов (  ^max );

5) отношение амплитуд максимумов ( ₁^max / ₂^max ).

При этом необходимо помнить, что экспериментальные условия, при которых проводятся абсорбционные измерения, существенным образом влияют на форму спектра поглощения. Так, в частности, все перечисленные выше параметры могут изменяться в зависимости от рН среды, ее температуры, полярности растворителя, концентрации исследуемого вещества и т.д.

Рис. 7. УФ-Спектры триптофана (в) и тирозина (б) в 0,1 н НС1 (1) и

0,1 н NaOH (2).

Далее спектр исследуемого соединения сравнивают с полученным при таких же экспериментальных условиях спектром данного соединения, приведённым в литературе или с полученным ранее с использованием заведомо известного образца. Наличие в исследуемом спектре всей совокупности полос с совпадающими с точностью до 1 нм положениями максимумов и до 10% значениями максимальных коэффициентов экстинкции свидетельствует о тождественности исследуемого и сравниваемого соединений. Появление лишних полос или увеличение интенсивности отдельных максимумов может быть вызваноприсутствием примесейв исследуемом растворе.

Спектральные характеристики отдельных хромофорных групп сильно отличаются по величине. Поэтому для обнаружения определённых функциональных групп следует записывать спектры таких растворов, концентрация которых даёт возможность получить искомую полосу с оптимальной оптической плотностью в пределах 0,2 – 0,8.При использовании стандартных сантиметровых кювет концентрации (С) можно подбирать из соотношенияС0.43 / ^max.

Количественный спектрофотометрический анализ

Количественный спектрофотометрический анализ веществ проводится на основе закона Бугера-Ламберта-Бера, который устанавливает количественную взаимосвязь между поглощением света той или иной длины волны исследуемым веществом и его концентрацией:

D = (I₀ / I) = - T = ε_λ  С  l, (6)

где D- оптическая плотность;I₀иI- интенсивность падающего и вышедшего из образца пучка света соответственно;T- пропускание образца;С- концентрация поглощающего вещества, выраженная в моль/л;l- толщина образца, см;- молярный коэффициент экстинкции, М^-1см^-1.

Для определения концентрации вещества в растворе можно использовать следующие подходы.

1). Если заранее известно значение коэффициента молярной экстинкции при данной длине волны монохроматического света _ (лучше всего в одном из главных максимумов поглощения) то, зная толщину поглощающего слоя кюветы (длину оптического путиl), которая обычно указывается на ее боковой стенке, можно рассчитать концентрацию исследуемого вещества по формуле:

С = D /   l

Для многих веществ _хорошо известны и представляют собой табличные значения. Однако при использовании заранее известного значения_необходимо стараться точно воспроизвести условия, при которых оно было определено.

2). Если есть возможность приготовить стандартный раствор вещества с известной концентрацией (С_ст) (взяв точную навеску), то можно определить концентрацию вещества в исследуемом растворе (С_х), не зная_. В этом случае пользуются следующими формулами:

D_ст =   С_ст  l ; D_х =   С_х  l ; D_x / D_cт =   С_х  l /   C_ст  l ;

=> С_х = D_x  C_cт / D_ст

Разумеется, измерения D_стиD_хследует проводить в одинаковых условиях: при одной и той же длине волны (лучше всего в главном максимуме поглощения), в одном и том же растворителе, при одинаковой толщине кюветы.

3). Графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах DиC. Для построения калибровочного графика измеряют поглощение серии растворов данного вещества с известной концентрацией. Получаемый график обычно представляет собой прямую линию, тангенс угла наклона ( tg_) которой равен_ l(приl= 1 см tg_=_). ИзмеривDисследуемого раствора, можно по калибровочному графику определить концентрацию вещества.

4). С помощью абсорбционного анализа можно одновременно определять концентрацию нескольких веществ в растворе при условии, что спектры их поглощения различаются по форме. Если компоненты смеси не взаимодействуют между собой, то измеряемая оптическая плотность будет представлять сумму оптических плотностей компонентов (поскольку Dесть величина аддитивная).

В случае двухкомпонентной системы (вещества А и В):

D = D_A + D_B = _A  С_A  l + _B  С_B  lдля любой длины волны.(7)

Измеряя Dпри двух длинах волн и зная молярные коэффициенты поглощения обоих компонентов при этих длинах волн, можно определить концентрации обоих веществ из системы двух уравнений:

D^1 = _A^1  C_A  l + _B^1  C_B  l, (8)

D^2 = _A^2  С_A  l + _B^2  C_B  l. (9)

Решение этой системы уравнений дает следующие выражения для концентрации веществ:

D^1  _B^2 - D^2  _B^1

С_A = ------------------------- , (10)

_A^1  _B^2 - _A^2  _B^1

D^2  _A^1 - D^1  _A^2

C_B = ------------------------- . (11)

_A^1  _B^2 - _A^2  _B^1

Выбранные длины волн₁и₂должны быть такими, чтобы молярные коэффициенты поглощения компонентов смеси при этих длинах волн различались максимально, т.е. чтобы при₁_A>>_B(поглощает свет преимущественно компонент А), а при₂_B >>_A(поглощает свет преимущественно компонент В). Это условие часто, но не всегда, выполняется, если₁и₂соответствуют максимумам поглощения компонентов. Чем дальше расставлены максимумы и чем они резче выражены, тем выше точность определения концентраций.

Аналогичным способом определяется концентрация веществ в многокомпонентных смесях (число длин волн, при которых проводятся определения, равно числу компонентов смеси), однако точность определений резко уменьшается с увеличением числа компонентов.

В случае, если молярные коэффициенты экстинкции неизвестны, их следует определить, измерив oптические плотности стандартных растворов известной концентрации для каждого из компонентов при₁ и₂.

Закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется не всегда. Зависимость DотСможет по разным причинам отклоняться от линейной. Количественное определение вещества по результатам измерения спектров поглощения можно проводить в том случае, если выполняются следующие требования:

1. измеряющий световой пучок является монохроматическим;

2. поглощающие молекулы распределены по всему объему образца равномерно;

3. поглощающие молекулы в пределах исследуемых концентраций не изменяют характера взаимодействия друг с другом и молекулами среды (= соnst для данной длины волны);

4. выходящий световой поток ослабляется только за счет поглощения фотонов (светорассеяние, отражение, люминесценция и другие явления не влияют на регистрируемый световой поток);

5. интенсивность измеряющего светового пучка и время жизни поглощающих молекул в возбужденном состоянии таковы, что концентрация невозбужденных (способных поглощать свет) молекул не изменяется в ходе измерения;

6. измеряющий световой пучок не вызывает фотохимических превращений поглощающих молекул.

В случае отклонений от закона Бугера-Ламберта-Бера нужно строить градуировочные графики, связывающие наблюдаемые величины оптической плотности и известные концентрации, и путём графической интерполяции находить концентрации исследуемых растворов.

При количественном спектрофотометрическом анализе главная задача исследователя – измерить концентрации, а значит, и оптические плотности растворов с большей возможной точностью. Ошибка измерения оптической плотности в сильной мере зависит от самой величины измеряемой оптической плотности.

Минимальная ошибка определения наблюдается при величине оптической плотности равной D_опт.= 0.43 (Т_опт.= 36.8 %). Ошибка измерения резко возрастает при малых значениях оптической плотности (D< 0.1), а также при очень больших значениях (D> 1.2). Оптимальным для измерения считается диапазоном оптических плотностей 0.2 – 0.8 (что соответствует интервалу пропусканий 15 – 65 %), при котором относительная ошибка увеличивается незначительно.