Пористое стекло
Путем специальной обработки щелочно-боросиликатного стекла и последующей экстракции растворимого материала удается получить стеклянные шарики с хорошо контролируемым размером пор — типа CPG-10 («controlled pore glass»). В качестве матриц для гель-фильтрации они привлекательны своей жесткостью, химической инертностью и жаростойкостью (при стерилизации). Однако следует иметь в виду, что их поверхность несет небольшой отрицательный заряд и может сорбировать, а иногда и денатурировать белки. Пористое стекло, ассортимент которого включает 11 размеров пор (от 75 до 3000 А) и два, три или четыре диапазона диаметров шариков (от 20 до 400 МЕТИ), поставляется фирмами «BDH» («Glass granules CPG-10»), «Serva» («CPG-10») и «Sigma» («PG»). Последние две фирмы производят также пористое стекло, у которого поверхностный заряд блокирован химической присадкой глицеридов: «CPG-10 Polyol» («Serva») и «GG» («Glyceryl glass»; «Sigma»).
Принцип гель-фильтрации (подробно в картинках)
На колонку, упакованную сорбентом, наносят раствор образца. Важно: лимитирующим является объем раствора образца; для аналитических разделений он не должен превышать 0,1% от CV (общего объема колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10% от CV; в противном случае разделения сложно будет достичь!
Раствор образца, допустим, содержит три типа веществ: высокомолекулярные, среднего размера и низкомолекулярные.
Высокомолекулярные не могут поместиться в поры сорбента, поэтому их объем удержания равен свободному объему колонки. Они элюируются первыми.
Средние частицы помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объем удержания немного выше свободного объема. Они элюируется вторыми.
Маленькие вещества долго путешествуют внутри пор сорбента, могут там заблудиться и найтись не скоро. Их объем удержания намного выше свободного (чаще всего их объем удержания приближается к общему объему колонки, т.е. 100% CV). Они вымываются последними.
Матрицы для Гель-Фильтрации
Гель – гетерогенная система, в которой подвижная фаза (обычно водная) всегда находится внутри пор неподвижной фазы, называется гелевой матрицей Матрицы:
Низкого давления
Высокого давления
Основные области применения.
Очистка веществ, фракционирование по размеру
Разделение мономеров, димеров и агрегатов более высокого порядка
Обессоливание веществ и «перебуферирование»
Анализ высокомолекулярных примесей
Определение молекулярной массы аналита
При гель-фильтрации белковнеобходимо принимать меры для предотвращения ихадсорбциинасорбентеи не допускать ихденатурации.
В отличие от эксклюзионной хроматографиисинтетическихполимеровиолигомеров, используемой главным образом в аналитических целях, гель-фильтрациябелков- один из важнейших способов их выделения и очистки.
Определение молекулярной массы белка методом гель-хроматографии
Принцип метода. В значительном диапазоне элюционный объём белка (объём буфера, собранный после нанесения белка на колонку до появления наибольшей концентрации белка в вытекающем буфере (элюате)) является практически линейной функцией логарифма молекулярной массы белка. Пропуская через колонку, заполненную сефадексом или биогелем, исследуемый раствор белка и определяя элюционный объём ( Vэ), можно затем по калибровочной кривой найти значение молекулярной массы данного белка.
Для построения калибровочной кривой на колонку наносят различные белки с известной молекулярной массой и для каждого определяют величину элюционного объёма. Затем строят график, откладывая по оси абсцисс логарифм молекулярной массы, а по оси ординат – соответствующие значения Vэ.
Измерение объема элюции (VЭ).
Гель-хроматография, как метод определения молекулярной массы, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество. Не требуется выделять белокв чистом виде, так как примеси другихбелковне мешают определению. Каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемоймолекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определениемолекулярной массыдаже очень небольшого количестваферментав присутствии другихбелков, не обладающих аналогичной каталитическойактивностью.
