Осаждение белков сульфатом аммония

Обычно, когда говорят о высаливании, имеют в виду высаливание именно сульфатом аммония. Этому методу уже более 130 лет. Раньше он чаще применялся для разделения белков, сейчас, в основном, как дешёвый и удобный метод осаждения белков. При этом получается ещё и существенная очистка (при высаливании из клеточного экстракта можно расчитывать на приблизительно 2-10 кратную очистку).

• Почему именно сульфат аммония?

  • При равной молярной концентрации поливалентные анионы более эффективны для высаливания, чем моновалентные (отчасти из-за того, что имеет значение не концентрация соли, а ионная сила раствора), а поливалентные катионы даже препятствуют действию поливалентных анионов. Получается, что оптимально сочетание - это поливалентный анион с моновалентными катионами.

  • Эффективность высаливания убывает в серии Гофмейстера (Hofmeister):

Цитрат > Сульфат > Фосфат > Хлорид > Нитрат > Тиоционат

В этом же ряду убывает стабилизирующий эффект и возрастают хаотропные свойства соли. Таким образом, наиболее подходящие кандидаты: цитрат и сульфат. Сульфат более удобен из-за лучшей растворимости (например, при нормальной температуре растворимость аммонийных солей цитрата и сульфата равны примерно 2.5М и 4.1М); низкой цены и стабилизирующего влияния, которое он оказывает на большинство белков при концентрациях выше 0.5М.

• (NH₄)₂SO₄ преципитируют белки по двум механизмам

1. сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной (менее растворимой) за счёт взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами. Это взаимодействие более эффективно при pH<pI.

2. обезвоживание. Один ион SO₄^2- имеет 13-14 молекул H₂O только в первом гидратном слое и, возможно, больше - во втором. Если одна молекула сульфата координирует даже 15 молекул H₂O, то 3M сульфат аммония связывает 45 из имеющихся в воде 55M молекул H₂O.

2. Ионная сила раствора

I = ¹/₂ c_i(z_i)², где:

• c_i - концентрация иона;

• z_i - заряд иона.

Например, для 1M NaCl: I = ¹/₂ (1(1)² + 1(1)²) = 1 для 1M (NH₄)₂SO₄: I = ¹/₂ (2(1)² + 1(1)²) = 3

Растворимость белков

• Влияние ионной силы и температуры  При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка увеличивается при повышении концентрации соли, так как экранирование притяжения противоположно заряженных групп приводит к разрыхлению структуры белка.      При высокой ионной силе (>0.2M) - растворимость белка понижается из за высаливания и обезвоживания. Она падает экспоненциально с повышением ионной силы: log S = ß - K_sI, где:

S[^g/_l] - растворимость белка; I - ионная сила; ß; K_s - константы.

K_s - слегка различается для различных белков и почти не зависит от pH и температуры. ß - сильно зависит от белка, pH и температуры; повышение температуры вызывает понижение ß => уменьшение растворимости белка.

• Влияние pH.      При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка минимальна при pH равном изоэлектрической точке белка.      При высоких концентрациях (NH₄)₂SO₄ растворимость повышается с повышением pH, так как при низких pH сульфат ион компактизует белок взаимодействуя с положительно заряженными группами. Так что лучше проводить осаждение при pH<pI.

• Влияние начальной концентрации белка      Белки бывают двух типов. Для типа I растворимость не зависит от исходной концентрации белка; для типа II - зависит сильно.

По пунктам

п. 1.

2. Обычно, при концентрациях ниже 1М (25% от насыщения) осаждаются лишь крупные частицы, преагрегированные или очень крупные белки. Приемлемая серия концентраций: 0M; 1M(25%); 1.6M(40%); 2.4M(60%); 3.2M(80%).

3. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии - для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего "желания". Оптимальный вариант - это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1...2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3...5%).

п. 2.

4. Можно добавлять кристаллический ацетат аммония или насыщенный раствор (а если требуется высокая точность, то 4М раствор). Первый способ удобнее, когда требуется высокая концентрация сульфата аммония или не хочется сильно увеличивать объём образца. В любом случае, соль добавляется при непрерывном перемешивании, чтобы не создавалась слишком высокая локальная концентрация соли.

п. 3.

5. Чем выше температура, тем ниже растворимость белков, но тем выше опасность денатурировать белок. Обычно осаждение проводится при 0^oC, хотя благодаря тому, что (NH₄)₂SO₄ стабилизирует белки и предотвращает рост бактерий, её можно проводить и при 25^oC. Можно добавить только одно: проблема соосаждения примесных белков не отражена в должной мере. Для достижения равновесия, а значит максимальной степени очистки (она может быть существенной) раствору (суспензии) белка стоит постоять в холодильнике не один день (если хватит терпения).

п. 4.

6. Белковый преципитат опускается на дно пробирки, так как имеет плотность в районе 1.29^g/_ml (плотность насыщенного раствора сульфата аммония - 1.24^g/_ml).

7. Обычно достаточно 10', 4об./мин., 4^oC. При высоких концентрациях соли и низкой концентрации белка могут потребоваться большие время/скорость. При больших концентрациях белка, когда видны хлопья преципитата, можно сажать на совсем низкой скорости.

п. 8.

8. Обычно достаточно 1-2 объёмов осадка.

Последовательность операций при высаливании белка сульфатом аммония

1. определить аналитической раститровкой при каких концентрациях (NH₄)₂SO₄ осаждает нужный белок;

2. добавить к раствору белка нужное количество (NH₄)₂SO₄;

3. инкубировать приблизительно 30' со слабым перемешиванием на нужной температуре;

4. осадить преципитат центрифугированием;

5. если осаждение ступенчатое - добавить следующую порцию (NH₄)₂SO₄, повторить пп.3-4;

6. слить супернатант;

7. коротким центрифугированием сбросить на дно остатки супернатанта, убрать их пипеткой;

8. растворить белок в нужном буфере.