Определение методом гель-хроматографии

Принцип метода. В значительном диапазоне элюционный объём белка (объём буфера, собранный после нанесения белка на колонку до появления наибольшей концентрации белка в вытекающем буфере (элюате)) является практически линейной функцией логарифма молекулярной массы белка. Пропуская через колонку, заполненную сефадексом или биогелем, исследуемый раствор белка и определяя элюционный объём (V_э), можно затем по калибровочной кривой найти значение молекулярной массы данного белка.

Для построения калибровочной кривой на колонку наносят различные белки с известной молекулярной массой и для каждого определяют величину элюционного объёма. Затем строят график, откладывая по оси абсцисс логарифм молекулярной массы, а по оси ординат – соответствующие значения V_э.

Измерение объема элюции (V_Э).

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество: не требуется выделять белокв чистом виде, так как примеси другихбелковне мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемоймолекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определениемолекулярной массыдаже очень небольшого количестваферментав присутствии другихбелков, не обладающих аналогичной каталитическойактивностью.

Методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

Принцип метода. Элетрофоретическая подвижность белков (или их субъединиц – в случае олигомерных белков) в додецилсульфате натрияопределяется величиной их молекулярной массы и не зависит ни от аминокислотного состава, ни от значений изоэлектрической точки. Существует достаточно строгая пропорциональность между значениями логарифма молекулярной массы белков и их элетрофоретической подвижностью. Определяя элетрофоретическую подвижность исследуемого белка и сравнивая её с элетрофоретической подвижностью белков – маркеров с известной молекулярной массой, находят величину молекулярной массы исследуемого белка. Так как предварительная обработка белка и последующий электрофорез проводят в додецилсульфате натрия, то в данном случае фактически определяют молекулярную массу отдельных полипептидных цепей.

Аппаратура для электрофореза в додецилсульфате натрия и постановка эксперимента в общем те же, что и при обычном электрофорезе.

Подготовка образцов к электрофорезу. Белки ( одновременно обрабатываются исследуемый белок и белки-маркеры ) инкубируют 5 минут при 100^о в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0, содержащем 1% додецилсульфата натрия и 1% меркаптоэтанола, а затем диализуют против 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора, рН 7,0, содержащего 0,1% додецилсульфата натрия и 0,1% меркаптоэтанола.

Нанесение образца. Состав образца, наносимого на гель: 3 мкл 0,05 % бромфенолового синего, 1 капля глицерина, 5 мкл меркаптоэтанола, 50 мкл 0,01 М натрий-фосфатного буферного раствора, рН 7,0, содержащего 0,1% додецилсульфата натрия и 0,1% меркаптоэтанола и 10-50 мкл отдиализованного раствора белка.

Хранение геля: хранят гель в 7,5 % уксусной кислоте.

Обработка полученных данных. Подвижность белков определяют обычным способом относительно маркерной краски: μ_эф = S/S₁, где S и S₁ – расстояние, пройденное соответственно белком и маркерной краской. Значения подвижности белков–маркеров откладывают по оси абсцисс, а по оси ординат – соответствующие значения логарифма молекулярной массы. Используя полученный калибровочный график и зная подвижность исследуемого белка, можно найти величину его молекулярной массы.

Зависимость между молекулярной массойи относительной подвижностьюбелкапри диск-электрофорезе в полиакриламидномгелев присутствиидодецилсульфата натрия(в полулогарифмической системе координат).

1 - сывороточный альбумин; 2 - яичныйальбумин; 3 -пепсин; 4 - химотрипсиноген; 5 - мио-глобин; 6 -цитохром с; Х -белокс неизвестноймолекулярной массой.