СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ БИОХИМИИ
Очистка белков от низкомолекулярных примесей
Применение в определенной последовательности ряда методик позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых мешающих примесей солей. Для полной очистки белков от низкомолекулярных соединений в настоящее время используют методы диализа, распределительной хроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации.
При диализе применяют полупроницаемые мембраны, диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, В то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через неё в окружающую среду.
Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры.
Метод ультрафильтрации основан на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.
ДИАЛИЗ
Диализ— освобождение растворов высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощиполупроницаемой мембраны, т. е. перегородки. Диализ известен нам как "избирательная диффузия". Диффузия - это перемещение веществ от высокой концентрации к более низкой сквозь полупроницаемую мембрану. Избирательная диффузия - это диффузия, в процессе которой, в зависимости от мембраны, некоторые вещества будут проникать сквозь мембрану, а некоторые - нет. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через мембрану, а неспособные диализировать (проходить через мембрану) частицы остаются за ней. Простейший диализатор представляет собой мешочек из полупроницаемого материала, в котором находится диализируемая (очищаемая)жидкость. Вместо мешочка часто используют цилиндрический сосуд с полупроницаемой мембраной вместо дна. Мембраны делают из коллодия, целлофана, животных и растительных перепонок, синтетических материалов и др. Мешочек погружают в растворитель, например в воду. Постепенно концентрации низкомолекулярного вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа обычно крайне низка (недели).В основе диализа лежат процессы диффузии, и поэтому он идёт очень медленно. Диализ ускоряется с увеличением отношения площади мембран к объёму диализируемой жидкости, с повышением температуры, перемешиванием, созданием разницы в давлениях по разные стороны мембраны, частой или непрерывной сменой растворителя, в который переходят (диффундируют) через мембрану ионы или молекулы низкомолекулярного вещества.
Диализ применяют для устранения из растворов белка и ДНК нежелательных низкомолекулярных примесей или замены состава этих растворов.
Молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе
Его также применяют для очистки коллоидных растворов от примесей электролитови низкомолекулярных неэлектролитов. Диализ применяют в промышленности для очистки различных веществ, например в производствеискусственных волокон, при изготовлениилекарственных веществ.
Материал, прошедший через мембрану, называется диализат
Диализ в электрическом поле — электродиализ — в десятки раз ускоряет очистку диализуемых систем от электролитов. Простой электродиализатор (рис.) состоит из трёх камер, отделённых одна от другой мембранами. В среднюю камеру заливают очищаемую жидкость, в боковых проточных камерах расположены электроды, погруженные в растворитель. Ионы в постоянном электрическом поле направленно перемещаются к соответствующим электродам, проникая при этом сквозь мембраны из средней камеры в боковые. Особенно эффективен электродиализ с применением ионитовых мембран, изготовленных из ионообменных материалов. Мембраны в зависимости от знака электрического заряда на их поверхности пропускают преимущественно или катионы, или анионы. Многокамерные электродиализаторы с ионитовыми мембранами применяют в гидрометаллургии и атомной промышленности (для очистки сбросных вод, концентрирования растворов солей, разделения близких по свойствам элементов), при обессоливании морской воды. Диализ и электродиализ находят применение во многих технологических процессах, в физико-химических и биологических исследованиях, а также в медицине. Метод диализа, получивший название вивидиффузии, в 1913 был использован американским учёным Абелем для изучения составных частей крови живого организма. Кровь животного проходила из артерии в вену через коллодиевые трубки, помещённые в стеклянный цилиндр, заполненный физиологическим раствором. Аппарат Абеля явился основой конструкции искусственной почки, с помощью которой проводят гемодиализ. В 1938 году впервые для гемодиализа был применен целлофан, который в последующие годы длительное время оставался основным сырьем для производства полупроницаемых мембран.
Ультрафильтрация(отультра...ифильтрация),продавливание жидкости через полупроницаемую мембрану — проницаемую для малых молекул и ионов, но непроницаемую для макромолекул и коллоидных частиц. Ультрафильтрацию растворов, содержащих молекулы высокомолекулярных соединений, иногда называют молекулярной фильтрацией. Ультрафильтрацию можно рассматривать какдиализ под давлением или как обратныйосмос,если мембрана пропускает только молекулы растворителя. В последнем случае процесс часто называют гиперфильтрацией; при его осуществлении внешнее давление должно превышатьосмотическое давлениераствора.
Мембраны для ультрафильтров, обычно в виде пластин (листов) или цилиндрических патронов («свечей»), изготавливают из микропористых неорганических материалов, продуктов животного происхождения, но чаще из искусственных и синтетических полимеров (эфиров целлюлозы, полиамидов и др.). Максимальный размер проходящих через мембрану частиц (молекул) лежит в пределах от нескольких мкм до сотых долей мкм.Разделяющая способность (селективность) мембран зависит от их структуры и физико-химических свойств, а также от давления, температуры, состава фильтруемой жидкости и прочих внешних факторов.
Ультрафильтрация как метод концентрирования, очистки и фракционирования высокодисперсных систем и многокомпонентных растворов широко применяется в лабораторной практике, медицине, промышленности. Так, посредством ультрафильтрации очищают от ионных и не ионных примесей воду, органические растворители, жидкие топлива и масла; разделяют сложные смеси белков, алкалоидов и др. веществ; выделяют ферменты, витамины, вирусы; стерилизуют жидкости медицинского и фармацевтического назначения. Ультрафильтрацию используют в дисперсионном анализе,микробиологическом анализе, при анализе загрязнений воздушных бассейнов и природных водоёмов промышленными и бытовыми отходами
Типичные примеры применения ультрафильтрации:- концентрирование и очистка растворов белков, аминокислот; - удаление солей из препаратов РНК и ДНК; - удаление праймеров из ПЦР амплипированных ДНК; - удаление ферментов из препаратов ДНК перед клонированием; - удаление меченых аминокислот и нуклеотидов; - удаление белка из образцов; - подготовка образцов для ВЭЖХ; - очистка антител и гормонов из биологических жидкостей и ферментационных бульонов; - и др.
Гемодиализ - метод внепочечного очищения крови при острой и хронической почечной недостаточности. Во время гемодиализа происходит удаление из организма токсических продуктов обмена веществ, нормализация нарушений водного и электролитного балансов.
Гемодиализ осуществляют обменным переливанием крови (одновременное массивное кровопускание с переливанием такого же количества донорской крови), обмыванием брюшины солевым раствором (перитонеальный диализ), промыванием слизистой оболочки кишечника умеренно гипертоническими растворами (кишечный диализ).Наиболее эффективным методом гемодиализа является применение аппарата искусственная почка.
Проблема очищения кровизанимала медицинскую науку еще с античных времен. В древности считалось, что многие болезни происходят от смешения телесных жидкостей. Для их очистки применялись различные отвары и смеси растений и минералов. Данные действия были в массе своей не эффективны или даже вредны для больного. Интерес к очищению крови то вспыхивал, то угасал.
На качественно новый уровень проблема очищения крови вышла в начале XIX века, когда с развитием биохимиистали понятны многие процессы, протекающие в организме человека. Физические основы гемодиализа заложил в 1854 году шотландский ученыйТомас Грэхэм, опубликовав свой труд «Осмотическая сила». В этой работе он впервые описал способ изготовления полупроницаемыхмембраниз специально обработанногопергамента. С помощью данного метода стало возможно осуществлять разделениеколлоидныхикристаллоидныхрастворов. В своей работе он экспериментально доказал классические в настоящее время законыдиффузиииосмоса. Процесс диффузии кристаллоидных растворов черезпергаментную бумагубыл назван им «диализом». В своей работе он также доказал связь размеров молекулы и скорости диффузии. Чем молекула больше, тем меньше скорость диффузии. Спустя 50 лет Джон Джекоб Абель создал первый аппарат для удаления растворённых в крови веществ. Исследования проводились насобакахс удаленнымипочками. В ходе опытов была доказана возможность эффективного удаления из крови не связанных с белками азотистых соединений. Малая площадь фильтрующей мембраны у аппарата не позволяла эффективно применять его для очистки крови у людей. В качестве средства, предотвращающего свёртывание крови при прохождении через аппарат, использовалсягирудин—антикоагулянт, получаемый изпиявок. В связи с низкой эффективностью препарата, серьёзную проблему представляли тромбоэмболические осложнения.
Первый гемодиализ человеку (пациенту, страдающему уремией) был проведен вГерманииврачом Георгом Хаасом, в октябре 1924 года. В качестве антикоагулянта использовался очищенный гирудин, антигенные свойства которого не позволяли проводить диализ более 30-60 минут. В 1927 году впервые при гемодиализе в качествеантикоагулянтабыл применёнгепарин. Таким образом Хаас был первым, кто свёл вместе все составляющие, необходимые для успешного гемодиализа. Он применил эффективный и безопасный антикоагулянт, создал аппарат с мембраной большой площади, обеспечил эффективную подачу крови на фильтрующую мембрану.
Первый случай успешного выведения человека из уремической комы с помощью гемодиализа произошёл 3 сентября1945 года. Голландский медикВиллем Кольф, внедряя в клиническую практику гемодиализ, усовершенствовал аппарат, разработанный Георгом Хаасом. Основной целью, с которой применялся гемодиализ, была борьба суремией. В результате очистки крови с помощью гемодиализатора удалось снизить концентрацию мочевины в крови и вывести больную из комы. В результате проведённого лечения, 11 сентября 1945 года было достигнуто значительное улучшение состояния пациентки, устранена угроза жизни. Впервые на практике была однозначно доказана клиническая эффективность данного метода. В 1946 году Вильям Кольф издал первое в мире руководство по лечению больных уремией с помощью гемодиализа.
Началом эпохи хронического гемодиализа считается 1960 год, когда Белдингу Скрибнеру и Вейну Квинтону удалось решить проблему долгосрочного сосудистого доступа. 10 апреля 1960 в Чикагобыло объявлено о новом устройстве. Долговременный сосудистый доступ обеспечивался путем имплантации влучевую артериюиподкожную венудвух тонкостенныхтефлоновыхтрубок. Наружные концы шунта соединялись изогнутой тефлоновой трубкой, которая на время проведения гемодиализа удалялась, а к шунтам подключался гемодиализатор.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке
Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.
Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли
|
|
Механизм разделения
Элетрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит разделение за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.
SDS-электрофорез по Лэммли
В 1970 году Лэммли (англ. Laemmli) для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.
При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:
белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
собственный заряд полипептида не существенен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.
В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд (заряд на единицу массы) и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев.
Для проведения денатуририрующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,5 и концентрацию полиакриламида около 4 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида 10-20 %. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,5 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.
В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.
Визуализация продуктов разделения
Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание гелей красителем Кумасси (Coomassie blue) или серебром.
Денатурация белков
Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной пространственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-химических и биологических свойств при физиологических значениях температурыи рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторовбелкиподвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, подденатурациейследует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативноймолекулыбелка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическаяактивностьи т.д.). Большинствобелков денатурируетпри нагревании ихраствороввыше 50–60°С.
Внешние проявления денатурациисводятся к потерерастворимости, особенно визоэлектрической точке, повышениювязкостибелковыхрастворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признакомденатурацииявляется резкое снижение или полная потерябелкомего биологическойактивности(каталитической, антигенной или гормональной). Приденатурациибелка, вызванной 8Ммочевинойили другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частности,гидрофобные взаимодействияиводородные связи).Дисульфидные связив присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время какпептидные связисамого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковыхмолекули образуются случайные и беспорядочные структуры
При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирующих агентов возможна ренатурациябелкас полнымвосстановлениемисходной трехмерной структуры и нативных свойств егомолекулы, включая биологическуюактивность. Таким образом, приденатурациибелковаямолекулаполностью теряет биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для практических целей иногда используют процессденатурациив «мягких» условиях, например при полученииферментовили других биологически активных белковых препаратов в условиях низкихтемпературв присутствиисолейи при соответствующем значении рН . Прилиофилизациибелков(высушивание ввакуумепутемвозгонкивлаги из замороженного состояния) для предотвращенияденатурациичасто пользуются химическимивеществами(простыесахара,глицерин, органическиеанионы).
Определение молекулярной массы белка
Белкиотносятся квысокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру.Молекулярная массабелковколеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структурыбелка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол. масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.
Аминокислотный состав и последовательность аминокислотвыяснены для многих тысячбелков. В связи с этим стало возможным вычисление ихмолекулярной массыхимическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природебелковхимическое строение не выяснено, поэтому основными методами определениямолекулярной массывсе еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используютсяметоды седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определениемолекулярной массыбелковметодами седиментационного анализапроводят вультрацентрифугах, в которых удается создать центробежные ускорения (g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения. Обычно вычисляютмолекулярную массупо скоростиседиментациимолекулбелкаили седиментационномуравновесию. По мере перемещениямолекулот центра к периферии образуется резкая граница растворитель-белок (регистрируется автоматически). Оптические свойстварастворителяибелкаиспользуются при определении скоростиседиментации; последнюю выражают черезконстантуседиментацииs, которая зависит как от массы, так и от формы белковой частицы:
где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с растворомбелка, см.Константаседиментацииимеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величинаконстантыседиментации, равная 1•10–13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения константседиментациибольшинствабелковлежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.
Для вычисления молекулярной массы(М), помимоконстантыседиментации, необходимы дополнительные сведения о плотностирастворителяибелкаи другие согласно уравнению Сведберга:
где R – газовая постоянная, эрг/(моль•град); Т – абсолютнаятемпература(по шкале Кельвина); s –константаседиментации; ρ – плотностьрастворителя; v – парциальный удельный объеммолекулыбелка; D - коэффициентдиффузии.
Определение молекулярной массыбелковметодомультрацентрифугированиятребует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография иэлектрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколькобелковс известнымимолекулярными массамии строят график.