Выделение и очистка белков.
Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков из природных источников в химически чистом, гомогенном состоянии. Получение же белка в гомогенном состоянии - достаточно сложная задача. Как правило, биологический материал, являющийся источником выделения, содержит большое число белков, их комплексов друг с другом и другими биополимерами. Близкие свойства компонентов этой смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний. Трудности получения чистого белка связаны также с лабильностью белков и опасностью их денатурации, что сужает круг возможных методов выделения. Последовательность операций по выделению белков обычно состоит в следующем: измельчение биологического материала (гомогенизация); извлечение белков, точнее, перевод белков в растворенное состояние (экстракция); выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка.
Белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов (органические растворители, кислоты, щелочи). Поэтому обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, кристаллизация и др.), в данном случае бывают неприемлемы. Белки в этих условиях могут подвергаться денатурации, т.е. терять некоторые существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость, биологическую активность. В связи с этим разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре (не выше 4°С), с применением щадящих нативную структуру химических реагентов
Выбор исходного материала
Выбор исходного материала зависит от того, какая ставится цель. Если необходимо, например, изучить фермент определенного типа, безотносительно источника, выбирают тот, который содержит большие количества фермента, а сам источник доступен. При выборе организмов того или иного вида обращают внимание на легкость его выращивания. Из животных часто используют крыс, кроликов. Если источником является определенный орган, то берут его не у мелких лабораторных животных, а у крупных: быков, свиней. Однако в том случае, когда проводятся плановые исследования специфического белка из конкретного источника, его приходится использовать независимо от содержания нужного вещества.
В случае микроорганизмов существуют проблемы выращивания микробной массы в определенных условиях и в больших количествах. Для каждой группы микроорганизмов (грибы, дрожжи, бактерии) необходимы свои особые условия выращивания, сбора клеток и экстрагирования. Многие ферменты микроорганизмов индуцибельны. Культивируя бактерии в среде, богатой белками или углеводами, можно вызвать увеличение образования протеолитических ферментов или, соответственно, гликозилаз. Кроме того, уровень биосинтеза белков изменяется в процессе жизненного цикла микроорганизма, поэтому необходим предварительный анализ динамики роста иправильный выбор продолжительности выращивания биомассы. Чаще всего оптимальным периодом сбора клеточной массы является конец логарифмической фазы перед замедлением роста клеток.
Рис. 1. Рост микроорганизмов
Хранение материала
Как полученный материал, так и экстракт из него, следует хранить замороженными. При низких температурах, прежде всего, замерзает свободная вода, и кристаллы льда разрушают мембраны и органеллы, но не повреждают белки. Интересно, что при -15° (в бытовых холодильниках) некоторые соли буфера выпадают в осадок, изменяется рН раствора, а в оставшемся незамерзшем концентрированном растворе могут, хотя и медленно, работать протеазы (ферменты, гидролизующие белки). Поэтому температуру хранения необходимо снижать до -25° и ниже - до -80°.
Разрушение клеток и экстракция
Большая часть белков и ферментов, изученных в ранний период развития белковой химии, были внеклеточными. Причина этого в том, что такие белки сравнительно легко выделялись, внеклеточные белки более стабильны (часто имеют в своей структуре дисульфидные мостики), обладают небольшой молекулярной массой. Именно для этих белков первыми были установлены структуры: для лизоцима, рибонуклеазы, химотрипсина. Однако большинство белков локализовано внутри клеток. Как показала практика, они менее стабильны, часто не содержат дисульфидных связей. После того, как выбран источник выделения белка, следующим шагом является экстракция его из ткани.
Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния, т.е. подвергают дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной структуры. Эту процедуру, называемую гомогенизацией, проводят при помощи ножевых гомогенизаторов типа Уорринга или пестикового гомогенизатора Поттера–Эльвегейма. Для выделения ряда белков из плотных животных и растительных объектов часто используют валковые или шаровые мельницы (рис. 1.1).
Рис. 1.1. Лабораторное оборудование.
а – пестиковый ручной гомогенизатор: 1 – пестик, 2 – корпус, 3 – мотор, 4 – штатив; механический гомогенизатор (б) и шаровая мельница (в): 1 – корпус с электродвигателем и пусковым устройством, 2 – камера для измельчения материала.
Успешно применяется также метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, в основе действия которого лежит разрушение клеточной оболочки, вызванное кристаллами льда. Для дезинтеграции тканей используют также ультразвук, пресс-методы (замороженный биоматериал пропускают через мельчайшие отверстия стального пресса под высоким давлением) и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давление – выделяющийся газообразный азот как бы «взрывает» клетки.
Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты – вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.
Из органических соединений, помимо давно применяемых водных растворов глицерина, широко используют (особенно для солюбилизации) слабые растворы сахарозы. На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии применяют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со значениями рН от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Особенно широкое распространение получили трис-буферные системы, представляющие собой смеси 0,2 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана (HOCH2)3CNH2(сокращенно обозначают «трис») с 0,1 М раствором хлороводородной кислоты в разных соотношениях. Для выделения белков сыворотки крови используют способы их осаждения этанолом (см. метод Кона), ацетоном, бутанолом и их комбинации. Почти все органические растворители разрывают белок-липидные связи, способствуя лучшей экстракции белков.
Для получения из биологического материала белков в чистом, гомогенном, состоянии применяют различные детергенты, способствующие расщеплению белок-липидных комплексов и разрыву белок-белковых связей . В частности, для освобождения белков (ферментов), прочно связанных с биомембранами митохондрий или других субклеточных структур, применяют тритон Х-100, додецилсульфат натрия и дезоксихолат натрия.
Следует, однако, иметь в виду, что детергенты, вызывая разрыв белок-белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру белков.
Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Обычно объем раствора в 2-3 раза превышает объем ткани. После экстракции белка массу центрифугируют при 10.000-20.000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Смесь до центрифугирования называют гомогенатом. Жидкая фаза после осаждения нерастворимого материала (надосадочная жидкость или супернатант) носит название ≪экстракт≫.
После достижения полной экстракции белков, т.е. переводабелковв растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смесибелковна индивидуальныебелки. Для этого применяют разнообразные методы:высаливание, тепловуюденатурацию,осаждениеорганическимирастворителями,хроматографию,электрофорез, распределение в двухфазных системах,кристаллизациюи др.
Тепловая денатурация
На начальном этапе очистки для разделения белков иногда используют тепловую обработку. Она эффективна, если белок относительно устойчив в условиях нагревания, в то время как сопутствующие белки денатурируют. При этом варьируют рН раствора, продолжительность обработки и температуру. Для выбора оптимальных условий предварительно проводят серию небольших опытов.
Растворениебелковвводесвязано сгидратациейкаждоймолекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространствемолекулводы. По химическим и физическим свойствамвода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистогорастворителя. В частности,температуразамерзания ее составляет –40°С. В этойводехуже растворяютсясахара,солии другиевещества.Растворыбелковотличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающихгидратацию,белкилегко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении крастворубелкалюбых водоотнимающих средств (спирт,ацетон, концентрированныерастворынейтральныхсолейщелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаютсядегидратациямолекулбелкаи их выпадение в осадок.
Высаливание.При добавлении растворовсолейщелочных ищелочноземельных металловпроисходитосаждениебелковизраствора. Обычнобелокне теряет способности растворяться вновь вводепосле удалениясолейметодамидиализаили гельхроматографии.Высаливаниембелковобычно пользуются в клинической практике прианализе белковсыворотки кровии других биологическихжидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительногоосажденияи удаления балластныхбелковили выделения исследуемогофермента. Различныебелкивысаливаются израстворовпри разныхконцентрацияхнейтральныхрастворовсульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделенияглобулинов(выпадают в осадок при 50% насыщении) иальбуминов(выпадают при 100% насыщении). Высаливание при добавлении необходимого количества сульфата аммония для осаждения всех белков является эффективным способом концентрирования – при условии, что образец, который нужно сконцентрировать, не слишком разбавлен. Для получения раствора, приблизительно 85%-ного насыщения удобно растворить 60 г сульфата аммония в 100 мл. При такой концентрации немногие белки имеют растворимость выше 1 мг/мл. Но если исходная концентрация белка в растворе ниже 1 мг/мл, то перед высаливанием следует повысить ее, например, с помощью ультрафильтрации. На величину высаливаниябелковоказывают влияние не только природа иконцентрациясоли, но и рН среды итемпература. Считают, что главную роль при этом играетвалентностьионов. Действие разныхионовпринято сравнивать не по молярнойконцентрациисоли, а по так называемой ионной силе (μ), которая равна половине суммы произведенийконцентрациикаждогоиона(с) на квадрат еговалентности(V):
Тонкое разделение белков плазмы кровичеловека на фракции достигается при использовании различныхконцентрацийэтанолапри низкойтемпературе(от –3 до –5°С) по методу Кона (рис. 1.2). В этих условияхбелкисохраняют свои нативные свойства. Указанным методом часто пользуются для получения отдельных фракцийкрови, используемых в качествекровезаменителей.
Рис. 1.2. Диаграмма фракционирования белков плазмы кровичеловекаэтанолом(по методу Кона).
Наиболее часто для осаждения белков используется ацетон. Он обладает меньшим денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при минусовой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. Методика осаждения состоит в следующем: образец обычно охлаждают до 0° С в ледяной бане со льдом. Концентрация белка может быть 5-30 мг/мл, а концентрация соли не должна быть высокой. Высокая концентрация соли снижает электростатическую агрегацию, и требуются более высокие концентрации растворителя, что увеличивает вероятность денатурации. При низкой концентрации соли может образоваться тонкая взвесь, которую трудно осадить. Оптимальная концентрация соли - 0,05-0,2 М. Растворитель добавляют медленно, чтобы избежать разогрева. Большинство белков осаждается при добавлении 20-50% растворителя (по объему). Следует отметить, что процентное содержание не совсем точный термин. Если к 50 мл ацетона добавить 50мл воды, то общий объем жидкости составит только 95 мл. После уравновешивания смеси в течение 10-15 минут осадок отделяют центрифугированием. Затем осадок растворяют в холодном буфере. Обычно объем буфера в 2 раза превышает объем осадка. Небольшие количества органического растворителя (около 10% по объему) не мешают дальнейшему фракционированию. Если температура при фракционировании органическими растворителями высока, происходит денатурация белка. Однако некоторые ферменты обладают высокой стабильностью, и денатурация носит избирательный характер.