3.3. Спектроскопия ямр 13с

Спектроскопия ЯМР ¹³С позволила обнаружить, что в области резонанса аномерных атомов углерода спектры альгинатов, полученные с помощью спектрометра на 25 МГц, содержат не два (как можно было бы ожидать для полисахарида, построенного из остатков двух уроновых кислот), а четыре сигнала. Это означало, что положение сигналов атомов С₁обоих моносахаридов (как М, так иG) зависит от природы соседнего остатка. По интенсивностям этих сигналов можно оценить не только величинуM/G, но и рассчитать относительное содержание (F) пар звеньевMM,MG,GMиGG. Более того, сигнал атома С₅остатка М был представлен в спектре тремя линиями, что свидетельствовало о чувствительности положения сигнала к природе обоих соседних остатков. Это явление удалось использовать для количественного определения содержания в полимере триплетов с центральным остатком М. Было установлено, что центральная линия этого сигнала отвечает центральным остаткам М триплетов МММ иGMG, в более слабом поле находится соответствующий сигнал триплетаGMM, а в более сильном – сигнал триплетаMMG. Таким образом, долю двух последних триплетов в молекуле альгината можно было определить непосредственно по интенсивности соответствующих сигналов, а вероятность нахождения триплетов МММ иGMGв цепи полимера можно было рассчитать из следующих соотношений:

F_mmm +F_gmm = F_mm иF_gmg + F_mmg -= F_mg .

Расчетные данные для нескольких альгинатов хорошо совпали с результатами химического анализа. В то же время провести аналогичную оценку содержания триплетов с центральным остатком Gне удалось.

При использовании более высокоразрешающего спектрометра ЯМР на 50 МГц и тщательного подбора условий съемки удалось получить сигнал аномерных атомов углерода в виде восьми линий, соответствующих центральным звеньям восьми теоретически возможных триплетов первичной структуры. Интенсивности этих линий позволили рассчитать содержание триплетов каждого типа в нескольких образцах природных альгинатов. Частичное подтверждение справедливости этих расчетов было получено из анализа сигналов углеродных атомов карбоксильных групп и атомов С₄и С₅остатка М, также имеющих мультиплетную форму, и из сравнения расчетных данных с результатами химического определения. По содержанию триплетов можно рассчитать среднюю длину гомополимерных блоков:

N_{g > 1}=(F_g – F_mgm)/F_ggm и N_{m > 1} =(F_m – F_gmg)/F_mmg .

Интересно отметить, что для синтетических бинарных сополимеров, образующихся при полимеризации двух разных мономеров, можно математически определить наиболее вероятное расположение звеньев вдоль цепи в зависимости от исходных концентраций и относительной реакционной способности мономеров. В то же время блочный состав альгинатов, как правило, отличается от последовательности, вытекающей из подобных расчетов, что свидетельствует против механизма образования этих полисахаридов в результате сополимеризации двух моносахаридных предшественников и считается важным доводом в пользу альтернативного пути биосинтеза с участием полиманнуронан-С{5)-эпимеразы (см. выше).

Спектроскопия ЯМР ¹³С является чрезвычайно удобным методом структурной характеристики альгинатов, выделенных из различных природных источников или модифицированных с помощью ферментативной обработки. Этот прием был использован также для контроля за процессом биосинтеза альгината у бактерий. В то же время, надежность определения блочного состава в известной степени зависит от величиныM/Gисследуемого образца. Более точные результаты получаются для альгинатов с высоким содержанием одного из мономеров; если же величинаM/Gблизка к единице, то значения длины отдельных блоков, рассчитанные из спектров, могут заметно расходиться с данными, полученными в результате химического или ферментативного гидролиза.

Спектры ЯМР ¹³С могут получены не только для растворов, но и для твердых образцов альгинатов. В последнем случае разрешение пиков существенно хуже, особенно для сигналов аномерных атомов углерода.