Сироватка, що досліджується

I

Комплемент

VI

II

III

V

Антиген

VII

Гемолітична система

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

Осад еритроцитів

Осад еритроцитів

Гемоліз

Гемоліз

Гемоліз

Фізіологічний розчин

IV

Схема механізму РЗК для виявлення специфічних антитіл в сироватці крові обстежуваного

Додаток К

Постановка реакції термопреципітації за Асколі для виявлення антигену сибірки

Матеріал для дослідження (I) подрібнюють, заливають десятикратним об'ємом фізіологічного розчину і кип'ятять протягом 15 хвилин (II). Одержаний термоекстракт фільтрують до повної прозорості рідини (III). Одержаний фільтрат (IV) пастерівською піпеткою обережно нашаровують (V) на внесену попередньо в пробірку маленького діаметру сибіркову преципітуючу сироватку (VI). Якщо в досліджуваному матеріалі є антиген сибірки, то на межі контакту термоекстракту й сибіркової преципітуючої сироватки через 2 хвилини при кімнатній температурі утворюється тонке каламутно-біле кільце преципітації (VII).

Для уникнення спевдопозитивного результату реакції ставлять контролі:

1. преципітуюча сибіркова сироватка + стандартний специфічний преципітіноген

2. преципітуюча сибіркова сироватка + фізіологічний розчин

3. нормальна кінська сироватка + досліджуваний термоекстракт.

Перший контроль повинен бути позитивним, решта контролів – негативна.

Схема постановки реакції термопреципітації за Асколі для виявлення сибіркового антигену

II

IV

I

Пастерівська піпетка

Фільтрування

III

Досліджуваний матеріал

V

Кип’ятіння

VII

VI

Облік

Сибіркова преципі-

туюча сироватка

1

2

3

Контролі

Механізм реакції термопреципітації за Асколі

+

=

Преципітиноген

Преципітуюча сироватка

Комплекс АГ+АТ

Додаток Л

Схема постановки реакції наростання титру бактеріофага з досліджуваним матеріалом і на щільному живильному середовищі за методом агарових шарів Граціа

10^-6

10^-7

I

II

МПБ

По 0,5 мл

По 4,5 мл в кожну пробірку

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

10^-5

10^-10

10^-9

10^-8

III

При 37º С на 5-7 г.

По 2,5 мл 0,7% МПА 44-46°С

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Чашки з 1,5% МПА

Другий шар в кожну чашку

Підрахунок кількості стерильних плям і визначення титру

Додаток М

Схема визначення чутливості бактеріальних культур до антибіотиків методом дифузії в агар із застосуванням стандартних дисків

Розміщення дисків з антибіотиками на поверхні мпа

,

,

,

,

Бактериальна культура, що досліджується Висів бактеріальної культури ( газоном) на чашку з мпа

При 37ºС на 48 г.

,

,

Облік за діаметром затримки зони росту бактерій

,

,

,

Схема визначення чутливості бактерійних культур до антибіотиків методом серійних розведень

Постановка полімеарзної ланцюгової реакції (ПЛР) для виявлення ДНК збудника у дослідному матеріалі

Принцип ПЛР був описаний в 1986 р. До. Мullis, що одержав за це Нобелівську премію в 1993 р. В основі цього методу лежить багаторазове копіювання за допомогою ферменту ДНК-полімерази певного фрагменту ДНК, який є маркерним для даного виду.

Механізм копіювання такий, що комплементарне добудовування ниток може початися не в будь-якій точці послідовності ДНК, а тільки в певних стартових блоках — коротких двуниткових ділянках. Для створення стартових блоків в заданих ділянках ДНК використовують затравки (приманки) – спеціально синтезовані in vitro олігонуклеотиди завдовжки близько 20 нуклеотидів, так звані праймери. Праймери комплементарні послідовностям ДНК як на лівій так і на правій межах специфічного фрагмента і орієнтовані таким чином, що синтез ДНК, здійснюваний ДНК-полімеразою, протікає лише між ними. В результаті відбувається експоненціальне збільшення кількості копій специфічного фрагмента за формулою 2n, де n – число циклів ампліфікації. Оскільки праймери входять до складу фрагменту, що ампліфікується, його розмір визначається числом олігонуклеотидних пар між 5'-кінцями праймерів. Звичайно розмір фрагменту складає декілька сотень нуклеотидних пар.

Побудова нових ДНК ниток з дезоксирибонуклеотидтрифосфатів здійснює фермент термостабільна ДНК-полімераза, так звана Таq-полімераза. Процес ампліфікації полягає в повторенні циклів ампліфікації, що складаються з денатурації ДНК (1 хв.), „підпалу” праймерів (1—2 хв.) і побудови фрагмента (1—2 хв.).

Використовування термостабільної ДНК-полімерази дозволило автоматизувати процес ампліфікація за допомогою спеціального приладу, званого термоциклером. Цей прилад автоматично здійснює зміну температур згідно заданій програмі і числу циклів ампліфікації.

В результаті 30—35 циклів ампліфікації синтезується 108 копій фрагмента, що робить можливим візуальний облік результатів після електрофорезу в агаровому або акріламідному гелі.

Допоміжним засобом для реєстрації є трансілюмінатор – джерело ультрафіолетового випромінювання яке використовується для дослідження люмінесцентних „слідів” в рідинах та гелях. На сьогодні задачу швидкого (протягом декількох хвилин) отримання зображення гелю й повного кількісного аналізу ДНК/РНК-фрагментів дедалі частіше вирішують з допомогою системи гельдокументації. Остання включає високочутливу CCD-відеокамеру з Zoom-об'єктивом і спеціальним УФ-фільтром флуоресцентних ДНК/РНК-фарбників, які звичайно використовуються; цифрову відеокарту для PC (аналого-цифровий перетворювач) з високим дозволом; комп'ютерну програму для отримання і архівації зображення гелю; комп'ютерну програму для кількісного аналізу і визначення розміру/маси ДНК/РНК-фрагментів в агаровому гелі; повне комп'ютерне забезпечення; сучасний digital термопринтер; темну камеру з вбудованим в неї трансілюмінатором й кріпленням для камери.

Таким чином, виконання ПЛР включає:

1. Підготовку матеріалу до виділення ДНК

2.Виділення тотальної ДНК.

3.Отримання одноланцюгової ДНК (температурна денатурація).

4. Зниження температури.

5. Внесення у препарат з одноланцюговою ДНК термостабільної ДНК- полімерази

6. Внесення в препарат з одноланцюговою ДНК та термостабільною ДНК- полімеразою праймерів-затравок та нуклеотидів (будівельні матеріали для майбутньої ДНК).

7. Процес ампліфікації з допомогою термістера (Синтез нових молекул ДНК, підвищення температури, температурна денатурація, зниження температури, внесення праймерів та нуклеотидів, синтез нової ДНК, температурна денатурація (повторення 30-40 циклів).

8. Проведення електрофорезу чи реакції гібридизації НК.

9. Облік та аналіз результатів.

Схема постановки ПЛР для виявлення ДНК збудника у дослідному матеріалі

І

ІІ

Досліджуваний матеріал (кров та інші рідини)

Підготовка клінічного матеріалу (сироватка крові чи подрібнений біоптат, гній, мокротиння. осад сечі)

шляхом центрифугування мініцентрифузі

( 14 000-20000 об/хв.))

Виділення тотальної ДНК

Одноланцю-гова ДНК

Досліджуваний матеріал (гній, мокротиння., біоптати тканин такнинта інші рідини)

Підготовка дослідного матеріалу шляхом подрібнення в лабораторному блендері з наступним центрифугуванням

Ампліфікація у термоциклері

Внесення у препарат праймерів-затравок та нуклеотидів

Внесення у препарат термостабільної ДНК- полімерази

(Таq-полімераза)

V

VІ

VІІ

Електрофорез

Облік результатів

електрофорезу з допомогою системи гельдокументації

ІV

Зниження температури одноланцюгової ДНК (40º-65º С)

в термостаті з холодильником

Температурна

(90º-95º С) денатурація для отримання одноланцюгової ДНК

ІІІ

Й

ІХ

VІІІ