Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 9ver7

В культуре клеток дрозофилы хромосомные перестройки, индуцируемые ультрафиолетовым излучением, образуются преимущественно в гетерохроматине Х- и Y- хромосомиаутосом.Приобработкемутагенами дрозофил, несущих мутации по нарушениям рекомбинацииичувствительностикмутагенам, оказалось,чтоумутантовпогенуmus109около 80%индуцированныхразрывовкартированов гетерохроматине.

9.5.6. Поздняя репликация

Изучая распределение метки на радиоавтографахпослевключения3H-тимидина вклеткисперматоцитовкузнечикаMelanoplus differentialis, А. Лима-де-Фариа в 1959 году обнаружил4типамечения(Рис.9.25).

В части клеток метка полностью отсутствовала(Рис.9.25а),вдругойчастиклеток включение предшественника происходило только в эухроматин аутосом (Рис. 9.25б), в ядрахтретьеготипа-всеядрометилосьсплошь (Рис.9.25в),инаконецвчастиядервключение происходилотольковгетерохроматиновыйблок половых хромосом (Рис. 9.25г). Поскольку семенники у самцов этого вида состоят из группыфолликулов,вкоторыхсперматоциты объединены в цисты с синхронным прохождением мейоза, удалось показать, что четвертыйтипмечениясоответствуетнаиболее позднимстадиямS-периода.

Рисунок 9.25

Типы включения 3H-тимидина в ядра ранней пахитены мейоза Melanoplus differentialis (Из: Lima-de-Faria, 1959, в кн. Жимулев, 1993, стр. 34).Половыехромосомыэтоговидаформируют хромоцентр, который на всех рисунках показан в левой части ядра (объяснения в тексте).

Впоследующиегодыполученогромный объем экспериментальных данных, позволяющихсделатьобщийвыводотом,что в гетерохроматиновых районах хромосом завершениерепликацииДНКзадержано.

Сейчасдажепредполагают,чтопоздний синтез ДНК является единственным константным признаком гетерохроматина, известным до сих пор. Однако существуют и исключения: у некоторых видов мховпеченочников, включая род Pellia, на представителях которого Э. Хайц в 1928 году описал гетерохроматин, обнаруживающий к томужеС-окраску,гетерохроматиновыерайоны завершают репликацию рано. Полагают, что время репликации ДНК в районах конститутивного гетерохроматина может зависеть от того, когда он декомпактизуется в интефазе. Например, у ряда печеночников гетерохроматин компактен в G1-периоде, но становитсядиффузнымсначаломS-периода.К середине S-периода репликация в нем завершаетсяионопятьстановитсякомпактным.

9.5.7. Варьирование количества гетерохроматина

В 1929-1937 гг. в работах Лэнсфилда и Добжанского была открыта еще одна особенностьгетерохроматина-варьирование его количества в геноме. Например, у

Drosophila pseudoobscura Y-хромосома в разных популяциях представлена в семи вариантах,сильноразличающихсяподлине.

Замечательны различия в размерах точечной четвертой хромосомы у D. kikkawai (Рис.9.26).

Унасекомыхобнаруженызначительные вариации в размерах Х-, Y- и микрохромосом,

Рисунок 9.26

DSt Mt Lt Mm Lm Ssm Msm Lsm

Разные типы четвертой микрохромосомы D. kikkawai, встречающиеся в естественных популяциях (Из: Baimai et al., 1986, в кн. Жимулев, 1993, стр. 37).

которые обогащены гетерохроматином. С помощьюспецифическихокрасокпоказано,что варьирующей компонентой является именно гетерохроматин.

9.5.8. Формирование гетерохроматиновых районов хромосом в онтогенезе

Исследования А.А. ПрокофьевойБельговской, проведенные на ряде объектов (рыбы,амфибии,млекопитающие),привелиеек выводуотом,чтовраннемразвитииметафазные хромосомы значительно отличаются по морфологии от метафазных хромосом более поздних стадий развития: они тоньше, сильно декомпактизованы, в них не видны блоки гетерохроматина.Онаназвалатакиехромосомы ювенильными(Рис.9.27)

Увсехорганизмов, хорошоизученныхна стадияхраннегоэмбриогенеза, циклоп,вьюн, лосось, форель, ряд амфибий, мышь - интерфазные ядра самых первых делений дробления обладают примечательными особенностями. На стадии двух-четырех бластомеровонипредставляютсобойпузырьки неправильной формы с прозрачной кариоплазмой,гетерохроматиновыерайоны в нихнеобнаруживаются.Всеучасткихромосом в этих ядрах деспирализованы, ядрышко отсутствует. На стадии метафазы хромосомы представляют собой тонкие нитеобразные структуры. Последовательные деления бластомеров сопровождаются постепенным структурированиемядра,развитиемядрышка; хромосомы в метафазе приобретают свойственнуюданномувидуморфологическую

Рисунок 9.27

Хромосомы лосося Salmo salar. Слева - метафаза третьего деления дробления; справа - метафаза из поздней бластулы (ПрокофьеваБельговcкая, 1986, стр. 312).

структуру (см. Рис. 9.22). В составе гетерохроматина на этих стадиях развития выявляются главным образом гистоны, а вот негистоновые белки не обнаружены (Из: Прокофьева-Бельговская, 1986, стр. 312-313).

Хорошо изучено раннее развитие у дрозофилыдостадиибластулы(бластодермы). После оплодотворения происходит восемь быстрых синхронных делений ядер, которые затемначинаютмигрироватькповерхностияйца, продолжая деления. Уже около поверхности проходят еще 4 деления (циклы 10-13), в результатечегообразуетсясинцитийизодного слоя ядер. После образования клеточных оболочек вокруг ядер в интефазе 14-го цикла формируетсяклеточнаябластодерма.

Клеточныеделениядробленияпроходят очень быстро. Один митотический цикл протекаетвсреднемза10мин.Начинаяс12-го делениявремякаждогоциклаувеличивается:до 12,4мин-в12-м,до21,1минв13-м.Впервых 11-12деленияхвядрахневыявляютсяядрышки и хромоцентры, хроматин ядра представлен тонкодисперсной сетью, а митотические хромосомы не диффренцируются на эу- и гетерохроматин.

Как ядрышки, так и хромоцентры появляются на стадии бластодермы. При трансплантации ядер бластодермы в неоплодотворенное яйцо хромоцентры и ядрышки в них быстро исчезают, хроматин превращаетсявтонко дисперснуюсеть,иуже через 15 мин вновь начинаются деления дробления.

При окраске на С-гетерохроматин метафазные хромосомы первых 4-5 циклов деления (30-60 мин после оплодотворения) отличаются от таковых на стадии бластодермы или от хромосомнейробластов. Они имеют вид длинных тонких слабо конденсированных нитей. В кариотипе достаточно четко окрашивается только Y- хромосома,вприцентромерныхрайонахдругих хромосомвиднылишь“следы”окрашивания. СпецифическийдлягетерохроматинабелокHP1 до 5-6 циклов дробления в ядрах не обнаруживается. Надежно выявляется HP1 белок начиная с 10-11 цикла. В это же время в

хромосомахначинаетсятранскрипция.Таким образом, стадия бластодермы является критической,вэтовремяактивируютсягеныи одновременнохромосомадифференцируется наэу-игетерохроматин.

9.5.9. Повторенные последовательности

У эукариот существенная часть генома состоит их коротких многократно повторенных последовательностей, состав оснований которых отличается от среднестатистического состава нуклеотидов основной части генома. Повторенные последовательности ДНК могут быть охарактеризованыспомощьюдвухподходов: по их исключительно высокой скорости ренатурации или градиентном центрифугировании в хлористом цезии. В последнем случае основная часть ДНК составляет главную полосу осаждения (главный пик), а повторенная фракция в силу обогащенности определенным набором нуклеотидов и, следовательно, другой молекулярноймассы,даетоднуилинесколько дополнительных (сателлитных) полос (Рис. 9.28).

Все данные, полученные до сих пор с помощью гибридизации in situ, свидетельствуюто том, что сателлитная ДНК располагается в участках прицентромерного гетерохроматина в метафазных хромосомах ивхромоцентрахинтерфазныхядер.Иногда, оченьредко,некотороеколичествосателлитных последовательностей локализовано в эухроматине.

Кроме сателлитов в прицентромерном гетерохроматине располагаются умеренные повторыгеноврибосомнойДНК.АнализвысокоповторенныхДНКдрозофилыпозволяетразбить их на три группы в соответствии с составом нуклеотидовистепеньюповторенности:

1.Фракция,осаждающаясявзоне1,679г/ см3 и состоящая из последовательностей рибосомнойДНК;2.Сателлиты,состоящиеиз повторенных 5-10 п.н.; 3. Сателлит, осаждающийся в зоне 1,688 г/см3. Это тандемныйповтордлиной359п.н.

Клонирование коротких (300-600 п.н.) фрагментов,выделенныхизразличныхтрактов сателлитных ДНК с последующим определением последовательностей нуклеотидовпоказалследующее:

1.Всего найдено 11 типов сателлитных ДНК,четыреизнихмажорныеисемь-минорные.

2.Как правило, разные сателлиты есть в каждой хромосоме, однако, есть и сателлиты, специфичные для определенных хромосом, например,сателлит359п.н.(Рис.9.29).

3.Как правило нуклеотидный состав повторов гомогенен, единичные замены нуклеотидов встречаются на 1 т.п.н., хотя в некоторыхслучаяхчастотызаменмогутбытьв 100развыше(Рис.9.30).Каждаягоризонтальная полосапредставляеткопиюповтора.Еслиесть замены, то указан новый нуклеотид в данном положении.

4.Среди сателлитных последовательностейчасторасполагаютсямобильные элементы(т.е.умеренныеповторы).

Рисунок 9.28

1.700

1.692

1.688

1.671

1.691

1.721 1.679

1.691

1.687

1.676

1.670

Распределение фракций ДНК из генома

Drosophila virilis (вверху), D. americana (в центре) и их гибрида (внизу) в градиенте плотности нейтрального CsCl (Из: Gall, Atherton, 1974, в кн. Жимулев, 1993, стр. 46).

Глава 9

Рисунок 9.30

AATAACTAG AATAG AATAG

152 G A GA

GA T

154

T

A

A

G

200

202

A

A

G

C

252

в группы. На сегодняшний день известно 9 гаплотипов Y-хромосомы человека. Они поразномупредставленывразныхпопуляциях(Рис. 9.32).

Данные, показанные на Рисунке 9.32 свидетельствуютотом,чтоконцентрациятехили иныхгаплотиповсущественноварьируетвразных популяциях.

Строение и функционирование хромосом

Рисунок 9.31

прошло

настоящее

Линейная передача Y-хромосомы у человека. В каждом поколении часть Y- хромосом данной популяции передается следующему поколению (темные полосы), а другая часть - нет (светлые полосы) (Из: Jobling, Tyler-Smith, 1995, p. 451).

Af

4

P

2, !K

Med

J

1

3

Am

Встречаемость гаплотипов Y-хромосомы человека в различных популяциях (Из: Jobling, Tyler-Smith, 1995, p. 454). По вертикали - гаплотипы: Af - африканский, P - пигмеи, !K - !Кунг, Med - Средиземноморский, J - японский, Am - американо-индейский. Большой черный кружок - означает широкое распространение данного гаплотипа в популяции, маленький черный кружок - редкая встречаемость гаплотипа в популяции, белый кружок - встречаемость у отдельных особей.

Глава 9

Рисунок 9.35

Sd Rsp-i

SD

+

Sd+ Rsp-s

SD

+

Схема взаимодействия генов в системе SdRsp. (Из: Doshi et al., 1991, в кн. Zhimulev, 1998).

генами:частотывстречаемостигеновнаединицу длиныДНКвгетерохроматиневторойхромосомы составляют примерно 1% от таковой для эухроматина.

Âтретьей хромосоме с помощью аналогичныхэкспериментоввыявлено12генов,а значит,плотностьгеноввгетерохроматинеэтой хромосомыпримернотакаяже, какивовторой хромосоме.

Несколько генов из гетерохроматиновых районоввторойхромосомыбыликлонированыи охарактеризованы: например, ген rolled кодирует белок, гомологичный митоген- активируемойпротеин-киназе,ген concertina кодирует альфа-субъединицу G-протеина, играющего роль в межклеточных коммуникациях в ходе эмбрионального развития.

Представляет интерес система взаимодействующих локусов SD-Rsp, из которых Rsp расположен в гетерохроматиновой секции 39 второй хромосомы (см. Рис. 9.34).

Âлевом плече эухроматиновой части второй хромосомы был обнаружен ген SD

(Segregation Distortion), мутация которого у гетерозиготных самцов Sd/Sd+ приводит к существенному сдвигу в числе гамет,

имеющих аллель Sd по сравнению с числом гамет Sd+. С помошью электронной

микроскопии установили, что спермиогенез гамет Sd+ â Sd/Sd+ генотипах нарушен из-за сильной декомпактизации хроматина. Как выяснилось, ген Sd взаимодействует с геном Rsp, расположенным в гетерохроматине.

Строение и функционирование хромосом

Рисунок 9.36

240 bp →

Варьирование числа копий Rsp-повтора в линиях D. melanogaster, различающихся по чувствительности Rsp (Из: Wu et al., 1988, p. 64, в кн. Zhimulev, 1998).

Известны два аллеля Rsp-i (insensitive) и Rsp- s (sensitive). Линии с нарушенным расщеплениемгаметимеютгенотип: Sd, Rsp- i/Sd+, Rsp-s (Ðèñ. 9.35).

Как выяснилось локус Rsp является районом повторенной ДНК, где единицей повтора является фрагмент в 120 п.н. Этот фрагментобогащенАТ-нуклеотидами,имеет общую структуру сателлитной ДНК и организованкакдимер,ограниченныйсобоих концов последовательностью TCTAGA (сайт рестрикции XbaI эндонуклеазы). В целом около 600 т.п.н. приходится на локус Rsp в линииsensitive.ХромосомаSdимеетделецию района Rsp и менее 20 копий XbaI-сателлита. Rsp-ss (super sensitive) может иметь 3000 и более копий (Рис. 9.36).

ДНК,расщепленная XbaIрестриктазой, из линий: supersensitive (lpcb), sensitive (cn, bw) и частично чувствительной (Canton-S), гибридизовалась с радиоактивно меченым клоном ДНК, содержащим XbaI-повтор.

Другой ген этой системы Sd, расположенный в эухроматиновом районе

37D5,картируетсяв EcoRIфрагментедлиной 7 т.п.н., с которого считывается транскрипт длиной 4 т.п.н.

Согласно представлениям некоторых авторов, ген Sd синтезирует белок, обладающий высокой способностью связыватьсясДНКRsp.ПоэтомууклетокRsp- s многоXbaI-сателлитнойДНКималобелков (Sd+), связывающихся с ней и компактизующих е¸ в ходе спермиегенеза, в результатечегоуменьшаетсячислогаметSd+,

Rsp-s.

Цитогенетические карты гетерохроматина Х- и Y-хромосом представлены на Рис. 9.37 и 9.38.

Краткаяхарактеристиканекоторыхгенов, расположенных в гетерохроматине Х и Y хромосом:

bb -bobbed-участкилокализациигенов, повторенных 150-250 раз и кодирующих рибосомную 18 и 28S РНК.

cr - (compensation response) - увеличивают политенизацию генов рДНК, при потере одного из гомологов.