Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 9ver7

может быть потеряна ни при каких обстоятельствах. Акифьев отмечает, что в соматических клетках хромосомы могут быть реорганизованы в широких пределах, вплоть до их полного распада в макронуклеусах некоторых инфузорий. Однако, прохождение митоза и мейоза невозможно без типичных хромосом, поддерживающих критическую массу. Причины,определяющиекритическуюмассу, неизвестны.

Как кариотип, так и идиограмма позволяютморфологическихарактеризовать каждую хромосому, но очень часто не дают возможность получить четкую характеристику, позволяющую идентифицировать отдельные хромосомы. Такую возможность дают методы дифференциальныхокрасокхромосом.

9.4.3. Дифференциальные окраски хромосом

B 1968 г. T. Caspersson и его коллеги предложили метод окрашивания хромосом квинакрином (или акрихин-ипритом) с последующим облучением их ультрафиолетомииндукциейфлуоресценции. Оказалось, что в разных районах хромосом выявляется разное число сайтов связывания красителя. Сайты к тому же сильно варьировали по размерам и интенсивности свечения. Наборы флуоресцирующих полос создавалииндивидуальностьнетолькоцелых хромосом, но даже их плеч. В результате каждую хромосому оказалось возможным идентифицировать. Эта окраска получила название Q-окраска или Q-banding (от слова Quinacrine).

Â1971 году Shaw, Schnedl и Sumner предложили метод G- окраски. Препараты послепредварительнойщелочнойобработки

инкубируютвстандартномсолевомрастворе (2Ч SSC) а затем окрашивают красителем Гимзы-Романовского. В результате этой окраски появляются темные поперечные полосы.

Âнастоящее время существует большое число методов, с помощью

которых выявляется сегментация хромосом, но их можно подразделить на шесть основных классов. Эта классификация методов дифференциальной окраски была предложена Парижской конференцией (Paris Conference, 1971, Supplement); Q -, G -, R -, T-,C–окраскииокраскапоФельгену.Кроме того, позднее были разработаны методики дифференциального переваривания хромосом энзимами, а также флуоресцентные in situ гибридизации(FISH).

9.4.3.1. Q–окраска

Эффективными в выявлении гетерохроматинаявляютсяфлуоресцирующие красители,такиекакквинакрин(Q-окраска)и Хекст (Hoechst 33258 - H-окраска). Оба они связываются с районами хромосом, обогащенными А-Т парами, но механизмы окраскиунихразные.Квинакрининтеркалирует в молекулу ДНК, Хекст связывается с наружной стороны молекулы в ее узкой бороздке.

9.4.3.2. G–окраска

Этот тип дифференциальной окраски интересен по многим причинам. Прежде всего поперечные полосы являются удобными маркерами различных частей хромосом. Полосам присвоены определенные номера и относительно их картируют гены. На Рис. 9.15 представлена карта первой хромосомы человека с нанесенными сайтами мутаций, обуславливающих различные физиологические недостатки.

Однако, как выяснилось число полос и их интенсивность варьировали в работах разных исследователей. Парижская номенклатураустанавливаетнормычислаG+ полос в хромосомах человека. Кроме того, эти полосы должны быть в определенных позициях (Рис. 9.16).

В соответствии с номенклатурой существует три типа карт полос, составленных при уровне разрешения 400, 550 и 850 полос на геном человека. Кроме того существует высокоразрешающая

36

34

3

32

p

31

22

2

21

1 13

1 12

21

2 23

24

25

q 31

3

32

41

4 42

1

Рак груди (протоков) o Недостаточность енолазы Нейробластома o ?Гемолитическая анемия Rh-ноль

Эритробластоз плода

Эллиптоцитоз-1 Эритрокератодермия вариабельная Гипофосфатизация, младенческая Фукозидоз Поздняя подкожная порфирия

Порфирия, гепатоэритропоэтическая Недостаточность галактоэпимеразы

Ceroid lipofuscinos, нейронный-1, детский Недостаточность С8, тип I и II Лейкемия/ лимфома, Т-клеточная

Недостаточность ацил-CoA-дегидрогеназы, средняя цепь Болезнь кленового сиропа, тип 2 Недостаточность миоаденилатдеаминазы Недостаточность АМФ-деаминазы эритроцитов Гиперплазия надпочечников, тип II

Гипотироидизм, незобный Миопатия из-за недостатка ЦТФазы

Гипераммониемия из-за недостатка ЦТФазы

Болезнь Гоше, 2 и более типов Гемолитическая анемия в результате недостатка ПК Эллиптоцитоз-2 Пиропойкилоцитоз Сфероцитоз, рецессивный

Недостаточность антитромбина III Болезнь Шарко-Мари-Туз, тип Ib Подверженность к Vivax malaria Синдром Криглера-Наджара Немалиновая миопатия Недостаточность фактора V Lupus erythematosus, системный Нейропения, иммунная

Катаракта опоясывающая, пулверулентная

Хронический грануломотоз в результате недостаточности NCF-2 Гликогеноз VII

Недостаточность фактора XIIIB Недостаточность CR1 Недостаточность фактора H Синдром Ушера, тип 2 Синдром ван дер Вуда Недостаточность фумаразы

методика (High resolution) и карты, построенные с ее применением – около 1250 полос.

Маркировка хромосом с помощью G- метода позволяет идентифицировать индивидуальные хромосомы и их фрагменты, следитьзаихперемещениямив ходе эволюции,

под воздействием мутагенов и различных экологических факторов.

Кроме использования G-бэндинга в картировании фрагментов хромосом, сам по себе набор темных полос в хромосомах отражает определенное состояние этих районов. Установлено, что районы,

соответствующие G-полосам, обеднены генами, в них повышенное содержание A-T- нуклеотидов и LINE-элементов. ДНК из G- полос является поздно-реплицирующейся в S-периоде (см. Craig, Bickmore, 1993).

9.4.3.3. R-окраска

В результате инкубации препаратов хромосом в буферном растворе при высокой температуреилиприопределенномзначении pH с последующей обработкой красителем Гимзы выявляется сегментация хромосом, обратная G-сегментации. В R-полосах высокаяконцентрациягенов,ониобогащены GC-нуклеотидами, и SINE-элементами, и ДНК этих фрагментов рано реплицируются в S-периоде.

9.4.3.4. Т-окраска

Это,посуществу,вариантR-окраски,но окрашенные фрагменты, как правило, выявляютсяпреимущественнонаконцахплеч хромосом в районах теломер. В этих полосах обнаружена самая высокая плотность генов, оченьвысокаяконцентрацияGC-нуклеотидов иSINE-элементов.ДНКреплицируетсяочень рано.

9.4.3.5. Окраска по Фельгену

После мягкой щелочной обработки с последующей длительной экспозицией в холодном солевом растворе сегментация может быть выявлена с помощью реакции Фельгена.

9.4.3.6. C-окраска

В 1970 году М.Л. Пардью и Дж. Голл (M.L. Pardue, J. Gall) обнаружили, что прицентромерныйгетерохроматин(см.Раздел 9.5)вхромосомахмышипоследенатурацииренатурации ДНК окрашивается красителем Гимзыболееинтенсивно,чемэухроматин.Ав 1971годуТ.ШуиФ.Т.Арриги(T.Hsu,F.Arrighi) предложилиметодикуобработкупрепаратов хромосом,позволявшуюдифференцированно окрашиватьэу-игетерохроматин.Основными этапами процедуры являлись: денатурация ДНК хромосом в 0.7N NaOH, тепловая

ренатурация(650С)иокраскавраствореГимза. Обработавтакимобразомпрепаратыхромосом 20видовмлекопитающих,авторынашли,что районыприцентромерногогетерохроматина, выявляемого при обычных окрасках по большейплотности,интенсивноокрашивались, аэухроматиноставалсябесцветным.Авторы назвали эту процедуру обработки методикой окраски на конститутивный (С-constitutive) гетерохроматин,илиС-окраской(C-banding).

МеханизмС-окрашиванияневыяснен.И хотявбольшинствеслучаеврасположениеСокрашенных районов хромосом совпадает с локализацией сателлитных ДНК, известны и очень важные исключения, например, Y- хромосомаD.hydei несодержитсателлитных ДНК,нообнаруживаетчеткуюС-окраску.

Крометого,чтовраннемэмбриональном развитии гетерохроматин не окрашивается с помощьюC-окраски,вболеепозднемразвитии окраска этих же районов выявляется. Поскольку первичная структура ДНК сохраняется одной и той же, следует считать, что C-окраска выявляет белки, специфичные длягетерохроматина.

9.4.3.7. Дифференциальное энзиматическое переваривание хромосом

Гетерогенность распределения пар нуклеотидов в митотических хромосомах выявляется с помощью переваривания ферментамирестрикции.Участкихромосом, обогащенные повторами, не содержащими сайты для данного фермента, остаются неповрежденнымиивыявляютсяприокраске любыми красителями на ДНК, например, бромистым этидием. Очень часто такие участки выявляются в районах прицентромерногогетерохроматина.

9.4.3.8. Многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ

Вцитогенетикев1990-хгодахпоявились новые мощные методы, в основе которых лежит флуоресцентная in situ гибридизация нуклеиновых кислот (Fluorescent in situ

hybridization – FISH). Связано это с применением новых более эффективных флуорохромов и новых методов рестрикции микроскопическихизображений:CCD-камеры вместо фотокамер. Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветнаягибридизацияin situ.

Для получения многоцветных изображений FISH используют разные флуорохромы,которымиметятразныезонды ДНК.Информацияобинтенсивностисвечения каждого из флуорохромов записывается в компьютере отдельно, и каждому из таких изображенийприсваиваетсясвойсобственный псевдоцвет. Одновременное использование нескольких (n) флуорохромов позволяет получить значительно большее число псевдоцветов. Например, если фрагмент хромосомы,окрашенныйфлуорохромом(a), будет давать один псевдоцвет, фрагмент, окрашенный флуорохромом b, будет давать другойпсевдоцвет,тофрагмент,окрашенный a и b одновременно, будет давать третий псевдоцвет (Рис. 9.17).

Вдополнениекэтимдвумфлуорохромам обычно используют третий – для общей

окраски хромосом. Очевидно, что использование n флуорохромов позволяет одновременно определять локализацию 2n-1 фрагментовДНК.Тоесть,пятьфлуорохромов делают возможным анализ результатов одновременной гибридизации in situ 31 фрагментаДНК.

Для мечения каждой хромосомы своим цветом, ДНК этой хромосомы собирают микроманипулятором с препарата, амплифицируют с помощью полимеразной цепнойреакциииметяткомбинациейизтрех флуорохромов.Врезультатеданнаяхромосома приобретает свой псевдоцвет. Аналогичную операцию проводят с каждой хромосомой кариотипа в результате чего каждая хромосома приобретает свой собственный псевдоцвет (Рис. 9.18а). Окраска хромосомы более чем одним цветом свидетельствует о наличиитранслокации (Рис. 9.18б).

Если сделать библиотеку фрагментов ДНК не из целой хромосомы, а из отдельных участков индивидуальных хромосом, то можно идентифицировать положение этих участков (Рис. 9.19).

situ. Так, имея по одному клону ДНК из генов илипоследовательностей,расположенныхв4- x разных хромосомах D. melanogaster и локализовав их в политенных хромосомах какого-то другого вида, можно быстро установить соответствие между группами сцепленияD.melanogasterииндивидуальными хромосомами, а также группами сцепления другоговида.

Идентичные гены, расположенные в гомеологичных элементах хромосом разных видов,называютсинтенными,асамоявление гомеологии участков хромосом у отдал¸нных видов называется синтенией.

У представителей рода Chironomus также обнаружена обширная гомеология различных плеч хромосом, которая довольно легко выявляется по рисунку дисков. Эти данные используют для построения схем эволюционных взаимоотношений между различными видами этого рода. Уточняются таксономические данные хирономусов.

Широко применяются в последнее время опыты по перекрестной гибридизации ДНК одного вида с кариотипом другого, в результате чего в хромосомах разных видов можновыявитьзоныгомеологии.Например, в результате гибридизации ДНК человека с метафазными хромосомами тюленя выявлено свыше 30 гомеологичных сегментов, т.е. протяж¸нные районы хромосом одного вида присутствуют в хромосомах другого вида (Frö nicke et al., 1997).

Ещ¸ более впечатляющие примеры гомеологиибылиобнаружены присравнении строения генома у столь отдал¸нных видов как рыбка Fugu rubripes, обитающая в японском море, и человек. Известно, что у человека в 14-й хромосоме в районе локуса AD3, контролирующего развитие болезни Альцхаймера, расположены 3 других гена: дигидролипоамид сукцинилтрансферазы, S31iii125, S20i15, примыкающие к гену FOS. Первые три гена обнаружены в геноме рыбки Fugu, они также примыкают к локусу cFOS. ОтносительныйпорядокгеновcFOS,S31iii125

и S20i15 был одинаков у обоих организмов. Однако,уFuguэтитригеналежатвофрагменте 12,4 т.п.н., в то время как у человека они занимают участок более чем 600 т.п.н. Размер генома Fugu в7,5разменьше,чемучеловека, поэтомуплотностьгеновнаединицудлиныДНК унихвыше(Troweretal.,1996).

Литература к разделу 9.4.

Акифьев А.П. Концепция базигенома и критической массы хромосом эукариот.

Докл. Акад. Наук 332: 96-98, 1993. Алиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С.

Общая генетика. Москва, Высшая школа, 22, 1985.

Босток К., Самнер Э. Хромосома эукариотической клетки. Москва, Мир, 433-467, 1981.

Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. Москва, Высшая школа, 66-67, 1989.

Левитский Г.А. Морфология хромосом и понятие “кариотипа” в систематике.

Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции 27: 187-240, 1931.

Левитский Г.А. Морфология хромосом. История. Методика. Факты. Теория. В сб. Классики советской генетики. Ленинград, Наука, 171226, 1968.

Лобашев М.Е. Генетика (издание второе). Ленинград, Изд-во ЛГУ, 60-62, 1967.

Маккюсик В. Генетика человека. Москва, Мир, 22-27, 1967.

Прокофьева-Бельговская А.А. Строение и функция хромосом. в кн. Руководство по цитологии, т. 2. Москва-Ленинград, Наука, 280-329, 1966.

Пузырев В.П. Геномные исследования и болезни человека. Соросовский образовательный журнал 5: 19-27, 1996.

Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В. Многоцветие современной цитогенетики, или multicolor fish today. Вестник ВОГиС 11: 11-15, 2000.

Суонсон К., Мерц Т., Янг У. Цитогенетика. Москва, Мир, 1-280, 1969.

Craig J.M., Bickmore W.A. Chromosome bands – flavours to savour. BioEssay 15: 349-354, 1993.

Elisaphenko E.A., Nesterova T.B., Duthie S.M., Ruldugina O.V., Rogozin I.V., Brockdorff N., Zakian S.M. Repetitive DNA sequences in the

9.5.1. Компактизация хроматина

По данным Хайца, начиная с ранней профазы, гетерохроматиновые районы хромосом становятся легко заметными и отличаются от эухроматиновых более интенсивнойокраской.Вконцеметафазыэти различия исчезают. В телофазе эухроматиновые районы декомпактизуются, агетерохроматиновыеостаютсяположительно гетеропикнотичными и опять выявляются цитологически.Впоследующейинтерфазеони представлены многочисленными сильноокрашеннымизернамииликрупными блоками гетеропикнотичного материала, издавна называемыми хромоцентрами (Рис. 9.21).

Прицентромерныегетерохроматиновые районы окрашены более интенсивно. В интерфазных ядрах (г-е) гетерохроматин представленинтенсивноокрашеннымизернами -хромоцентрами.

Эта картина изменений состояния компактностипозволилаШульцу(J.Schultz)в 1947 году сформулировать представление о гетерохроматине как районах хромосом, которые имеют специфическое свойство оставаться в виде блоков в межмитотической стадии. Таким образом, эухроматин и гетерохроматин различаются по циклам

компактизации.Втовремякакпервыйпроходит полныйциклкомпактизации-декомпактизации отинтерфазыдоинтерфазы,второйсохраняет состояниеотносительнойкомпактности.

Однако постоянство компактности укладки гетерохроматиновых районов хромосом относительно. Об этом свидетельствуютследующиефакты:

1.Вклеточномциклененаходятсильного окрашивания гетерохроматина аутосом дрозофилы до стадии профазы.

2.Гетерохроматиновых районов не находят в хромосомах эмбрионов на самых раннихэтапахдробления.

3.В интефазных ядрах хромосом дрозофилычислохромоцентровварьируетот0 до5.Ихотсутствиеможетсвидетельствоватьо полной декомпактизации гетерохроматина на каких-тостадияхинтерфазы,возможно,вконце S-периода, когда реплицируется ДНК гетерохроматина.

4.В ходе митотического цикла гетерохроматин так же как и эухроматин компактизуется. При измерениях длин митотических хромосом дрозофилы, находящихсянаразныхстадияхкомпактизации, показано, что чем больше гетерохроматина в составе хромосом, тем меньше они укорачиваются. Измерения суммарных длин гетерохроматина всех хромосом дрозофилы