Подготовка у универсиаде 2012 / РНК интерференция
.pdf
Сборка комплекса (si)RISC
у Drosophila melanogaster
Dcr-1 (основнойфермент процессинга miРНК) и Dcr-2 (процессинг siРНК) обасовместно участвуютвразныхстадияхсборки siRISC!
Но Dcr-1 участвуетврепрессии трансляции, Dcr-2 неучаствует in vitro могутутилизовать одинаковыесубстраты, но in vivo активности отличаются:
Dcr-1 – есть PAZ, Dcr-2 – нет PAZ Dcr-1 - нет геликазнойактивности, Dcr-2 – есть геликазная активность
Tomari Y, Zamore PD.. GenesGenes DevDev.. 20052005
Каквыбираетсяактивная (антисмысловаяая)) цепьцепь??
Dicer и R2D2 образуют гетеродимер, вкотором R2D2 связывает более термодинамическирмодинамически стабильный 5’конец короткойдцРНК, а Dicer – менеестабильный. Такойй характерхарактер связывания предопределяет, какая цепьвитогебудетзаряженав RISC –аа именноименно цепьцепь,, 5’конецкоторойтермодинамически менее стабилен. Присутствие 5‘-фосфатаата нана концеконце sisiРНКРНК усиливаетсвязывание R2D2
Dicer R2D2
5′UAANNNNNNNNNNNNNNNGCCNN3CNN3′′
3′NNAUUNNNNNNNNNNNNNNNCGGG55′′
При “передаче” из Dicer/R2D2 в Ago ориентировка siРНК сохраняется. PIWI доменбелка Ago связывает 5' фосфорилированный конецактивнойцепи siРНК, а PAZ доменен –– ее 3' конец
Schwarz DS, et al. Cell. 2003 |
Еслистабильность 5’концов одинаковаинакова ((редкоредко)),, цепицепи |
Khvorova A, et al. Cell. 2003 |
включаютсяв RISC с одинаковойой частотойчастотой ((HeHe andand |
|
Hannon, 2004) |
Расщеплениепроисходитвцентре дуплексадуплекса siРНК - мишень
5′ |
Расщеплениемишенипроисходит всайтена |
|
расстоянии 10 нуклеотидов от 5′ конца siРНК |
AAAnAAAn
NAAGCCUGUGCCUCUUCAGCUACC
UUCGGACACGGAGAAGUCGAUGp5′
11,10
Hutvagner G, Zamore PD. Science. 2002
Расщеплениепроисходитвцентре дуплексадуплекса siРНК - мишень
5′ |
Расщеплениемишенипроисходит всайтена |
|
расстоянии 10 нуклеотидов от 5′ конца siРНК |
AAAnAAAn
NAAGCCUGUGCCUCUUCAGCUACC
UUCGGACACGGAUAAGUCGAUGp5′
|
|
11,10 |
незначимая |
менее |
Мутации в сайте расщепления |
позиция |
||
|
ответственный |
инактивируют siРНК! Мутации в других сайтах – |
|
участок |
РНК-интерференция может сохраняться. 1-2 замены |
|
|
– могут переноситься, 3-4 замены – снижение РНК- |
|
|
интерференции |
Hutvagner G, Zamore PD. Science 2002
РНК-зависимаяРНК-полимераза (RdRP)(RdRP)
RdRP – RNA-dependent RNA Polymerasease
Очередная поправка к “центральнойдогме” молекулярной биологии
9 Активность RdRP найденаурастений, грибов, C..eleganselegans
9можетслужитьфакторомусиленияэффектаРНК-интерференцииерференции
9необходима лидляРНК-интерференции?
•Невыявленаумлекопитающих и Drosophila
•RdRP – дефицитныерастения и черви – неоднозначныеые данныеданные
9можетучаствовать впроцессе, названном Randomom
degenerative PCR (Lipardi et al., 2001)
Схемаобразования вторичныхх sisiРНКРНК
1) siРНК, образовавшаяся в результате активности Dicer, расплетается и связывается с мРНК-мишенью
2)siРНК действует как затравка для RdRP
3)5’-3’ элонгация
4)образовавшаяся длинная дцРНК является субстратом для Dicer, который нарезает ее на вторичные siРНК→ амплификация siРНК
эффект ограничен расстоянием 300-500 н. в 5’ направлении от сайта первоначального расщепления
расщеплениемишенис участиемчастием RISCRISC
Lipardidi etet alal..,, 20012001
“Нормальная” мРНК связанасбелками CBP и PABP и защищеназащищена отот вовлечениявмеханизмы собственногосайленсингас участиемучастием RdRPRdRP
CBP – cap-binding protein
PABP – polyA-binding protein
PABP отсутствует
D. Baulcombe, Nature (2004)
Каждая молекула PABP связанас 30 аденозиновыми остатками
Обеспечиваетзащиту отобщейнуклеазной активности, ноповышение чувствительностиительности кк полиАполиА рибонуклеазе, котораяпостепеннодеградирует мРНКвцитоплазме Когдаостается 30 аденозинов – быстрая деградация мРНК
ОбщиепринципыРНК-интерференции -- summary:summary:
¾РНК-интерференция – древнийи консервативныйивный механизмРНК-зависимогосайленсинга
¾Ключевыесобытия:
расщепление дцРНК-индуктора докороткихдцРНК
взаимодействие активныхцепейкороткихдцРНК с РНКНК--мишеньюмишенью попо принципу комплементарностивсоставе рибонуклеопротеиновогопротеинового комплекса собязательным участием Ago-белков
Вкачествеиндуктораможетвыступать РНК самогосамого разнообразногопроисхождения
Механизмы сайленсинга отличаются большимим разнообразием, сайленсингможетбыть индуцировануцирован искусственно
Возможноэпигенетическое наследование эффектовффектов РНК-интерференции
Благодарю заа внимание!