Подготовка у универсиаде 2012 / РНК интерференция
.pdf
Функциональныедомены белковов AgoAgo
PAZ домен (подобен таковомуу Dicer) – 20 кДа, начальный контактнтакт ии связываниесвязывание сдцРНК (есть структура, котораяможетсвязывать оцРНК)
PIWI – 40 кДа, С-концевой домен, нуклеаза, формирует структуруру ““полумесяцаполумесяца””
Mid домен – совместнос PIWI формируетбороздкудля укладыванияывания дцРНКдцРНК заза счетэлектростатических взаимодействий
Функции другихдоменов недоконцаопределены
Домен PIWI подобендомену РНКазыНКазы HH
Song JJ et al. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 2004
PIWI отвечаетна направляемоеаправляемое дцРНК расщеплениеие оцРНКоцРНК
у некоторых Ago-подобныхых белковбелков известны идругие активностиности PIWIPIWI……
По крайней мере, у млекопитающих Ago2, входя в состав RISC, является слайсером
J. Liu et al., Science (2004)
Домен PAZ связывает 3' оверхэнги, типичныеые длядля sisiРНКРНК
Кристаллическаяструктурабелка Argonautergonaute
у P. furiosus (архебактерия)
Song JJ et al. Science (2004)
Прокариотическиебелки Ago способны in vitro включать короткиеороткие оцДНКоцДНК ии расщеплятькомплементарные имРНК-мишени! (Yuan et alal.. MolMol CellCell 20052005)).. In vivo назначениеэтойактивностиневыяснено, но … (см.. лекциюлекцию 3)3)
Вотличиеотэукариотических, невсесодержат PIWI доменен!!
Переходотпервойстадииковторойпроисходитс участиемтием DicerDicer
(покрайнеймере, увысшихэукариот
Dicer R2D2
Комплекс B (siРНК + гетеродимер Dicer/R2D2) объединяется сбелком Ago (умлекопитающих Ago2) и формируеткомплекс RLC (RISC Loading Complex)
RLC можетформироватьсяспривлечением дополнительных белков
Две цепи siРНК разделяются в составе RLC: дуплекс “перезаряжается” в Ago и цепи диссоциируют
Судьба второй цепи (passenger strand) может быть различной, диссоциирует и/или расщепляется белком Ago
Ago
Dicer R2D2
Ago
Dicer R2D2
Ago
Переходотпервойстадииковторойпроисходитс участиемтием DicerDicer (покрайнеймере, увысшихэукариот)
Две цепи siРНК разделяются в составе RLC: дуплекс “перезаряжается” в Ago и цепи диссоциируют
Активная цепь, связанная с Ago, попадает в активный комплекс RISC
Судьба DICER и R2D2 может быть различной (могут остаться ассоциированными с RISC)
Активнаяцепь siРНК спариваетсясмРНКмишенью в активномцентредомена PIWI
Распознавание мишени происходит за счет 5’конца активной цепи (seed sequence, позиции 2-8 от 5’конца).
Нуклеация, затем распространение дуплекса в 3’направлении вдоль активной цепи, вероятно конформационное изменение Ago, 3′ конец активной цепи удаляется из кармана PAZ
Dicer R2D2
Ago
??
? RISC
Dicer R2D2
Ago
РНК - мишень
?
? RISC
Dicer R2D2
РНК -
мишень Ago
Перестройкавсегокомплексапомещаетфосфатрасщепляемого сайтайта мишенимишени ((обычнообычно между 10 и 11 н. от 5’концаактивной цепи) вкаталитический центр доменадомена PIWIPIWI
Если комплементарность велика и РНКазный центрактивен, происходит Mg2+ зависимоерасщепление (слайсинг), затемдиссоциация мишени (усиливаетсяприналичии ATP) и деградация сучастием клеточных нуклеаз
Впротивном случае весьвесь комплекскомплекс
остаетсянамишени!!
RISC
“Репрессированные” Ago –– содержащиесодержащие mRNPmRNP агрегируют в P – тельца, гдеде репрессированнаярепрессированная мРНК можетлибо хранитьсяся,, либолибо деградироватьдеградировать сс участием деаденилирующихих ии декэпирующихдекэпирующих
ферментов
Участиекомплекса RISC в процессингеинге sisiРНКРНК
RISC
ATP
RISC
RISC
КороткаядцРНК (продуктдукт DicerDicer илиили
синтетическая) можетт включатьсявключаться вв
состав RISC без участиятия DicerDicer
Вэтом случаедве цепии дцРНКдцРНК
разделяютсязасчет АТФАТФ--зависимойзависимой геликазной активностии.. АктивнаяАктивная цепьцепь остаетсявсоставе зрелорелогого комплексакомплекса RISC, вторая удаляетсяся.. АктивнаяАктивная цепьцепь взаимодействуетс РНКНК--мишеньюмишенью.. ЕслиЕсли
происходит расщеплениение,, RISCRISC можетможет
выступатькак комплеекскс многоразовогомногоразового
действия (Novina and Sharp,Sharp, 20042004))
Высвобождениедвух продуктовпродуктов
расщепленияРНК-мишениени изиз RISCRISC
требуетАТФ. 3’фрагментнт расщепленнойрасщепленной
мРНКдеградируетв цитоплазмеитоплазме сс участиемэкзонуклеазы Xrn1,Xrn1, аа 5’фрагмент расщепляетсятся наборомнабором 33’’--55’’ экзонуклеаз в экзосомее
RISC
Семейство больших (~500-kDa) гетерогенныхРНК-- мультибелковых комплексов, вовлеченных вовсе путити РНКРНК-- зависимого сайленсинга
В “сердцевине” комплекса – белок Ago сактивным нуклеазнымнуклеазным
доменом (можетвыступать вкачестве “минимального RISCC))””
Другие возможные компоненты (до сих пор не все описаны, и ни в одном случае не определен полный набор):
¾РНК-связывающие белки, в т.ч. Ago ¾РНК/ДНК геликазы ¾Факторы ингибирования и инициации трансляции
¾RdRP (РНК-зависимая РНКполимераза) ¾трансмембранные белки
(предполагается роль у объектов, для которых показана системная RNAi –
растения и C. elegans)
¾Dicer’ы и другие компоненты RLC…
RISC
Приполностью комплементарномтарном спариванииспаривании центральнойчасти дуплексаа sisiРНКРНК сс мишеньюмишенью образуетсяспираль A-формыы напротивнапротив
консервативногоиважного длядля расщеплениярасщепления РНКРНК
мотива Asp-Asp-His в доменеене PIWIPIWI белкабелка AgoAgo..
Нарушенияструктуры спиралиали дцРНКдцРНК препятствуютрасщеплению ии приводятприводят кк трансляционной репрессии
RISC
Семейство больших (~500-kDa) гетерогенныхРНК-- мультибелковых комплексов, вовлеченных вовсе путиути РНКРНК-- зависимого сайленсинга
miRISC
coreRISC и holoRISC, промежуточные
формы уодногоитогожеобъекта – от
150 кДадо 3 мДа
RISC1?
siRISC
coreRISC 
holoRISC RISC2?
RITS
siRISC у Drosophila melanogasterogaster
Dcr-2 расщепляет дцРНК до siРНК, входитвсостав RLC Dcr-1 расщепляет предшественники miРНК
Ago2
От Tudor domain и Staphylococcal Nuclease domains – нуклеаза, ассоциируетс VIG-1 и короткимидцРНК, а такжесрибосомами
Ago-подобныебные белкибелки
ТакжеТакже вовлеченывовлечены вв
сборкусборку RISC:RISC: ArmitageArmitage ((геликазагеликаза??)) SpindleSpindle EE ((геликазагеликаза??)) Rm62Rm62 ((геликазагеликаза??)) Dmp68Dmp68 ((геликазагеликаза??)) ……
The Fragileagile--XX MentalMental Retardationation proteinprotein
(FMRP//dFMR1dFMR1))
консервативныйвативный репрессорсор трансляциияции вв нейронахнах