Подготовка у универсиаде 2012 / РНК интерференция
.pdf
Последовательность дцРНКопределяет, в какихких участкахучастках будетрасщепленамРНК-мишень
Кклеточному лизату Drosophila (бесклеточная система , в которойой возможнавозможна транскрипция итрансляция) добавляли меченую 32P рекомбинаантнуюнтную мРНКмРНК,, например, Rr-luc (Renilla reniformis (вид губки) luciferase), и инкубировалиовали сс комплементарными ейдцРНК. Затем РНК анализировали электрофорезомрофорезом вв денатурирующем ПААГ и радиоавтографией
равномерноемечениеРНК - |
мечение РНК попо 55’’ концуконцу -- |
виднывсепродуктыдеградации |
видны 5’ продуктыукты деградациидеградации |
Zamore et al. Cell (2000)
Эксперимент 1: клеточныйлизат Drosophila + равномерномерно меченая рекомбинантная дцРНК, комплементарная мРНКмРНК люцифераз, 2 часаинкубации, денатурирующий ПААГГ,, радиоавтография
Результат: |
образуются фрагментырагменты РНКРНК |
длиной 21-23 нн.. |
их образованиеие нене требуеттребует |
присутствия соответствующейоответствующей |
мРНК |
обецепи процессируютсяцессируются |
одинаково! |
Zamore et al. Cell (2000)
Эксперимент 2: клеточный лизат Drosophila + рекомбинантныее дцРНКдцРНК,, комплементарные разнымучасткаммРНК, одноцепочечная мРНК меченамечена попо 55’’ концу, денатурирующий ПААГ, радиоавтография
ПАГ-электрофорезрез высокоговысокого
разрешения продуктовдуктов деградации мРНКК RrRr--lucluc::
Промежуточные продуктыпродукты
расщепления отличаютсятличаются нана величину, кратнуюую 2121--2323 нн..
мРНК-мишень расщепляетсяасщепляется сс интервалом 21-2323 нн..
Меченые продукты деградации мРНК Rr-luc, вызванной добавлениемением дцРНКдцРНК (B)(B),, оказались на ~100 н. длиннее, чем для (C), для (А) – еще на ~1000 нн.. длиннеедлиннее
Zamore et al. Cell (2000)
DICER 
РНКаза III – подобный высокопроцессивный фермент Около 200 кДа АТФ-зависимый (ноестьисключения?)
ОдновременнорасщепляетдцРНК вдвухсайтах
Сложная структура (самыйсложныйизРНКаз III), многоого доменовдоменов Высоко консервативный Имеетсяумногих, еслиневсехэукариот СлабоесродствокоцРНК (в 3-40 разниже)
Ключеваярольв PTGS
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonucleaseribonuclease inin thethe initiation step of RNA interference. Nature 2001
Мутации DICER (какидругихкомпонентовсистемыРНК--интерференцииинтерференции)) вызываютсерьезныенарушенияразвития
Эмбрионамыши (Bernstein |
Цветка Arabidopsisidopsis((JacobsenJacobsen |
et al., Nature Genetics 2003) |
et al., Developmentelopment 1999)1999) |
DICER имеетнесколькофункциональных доменовменов::
9PAZ домен (неувсех!)
Piwi-Argonaute-Zwille
9Bridging domain (междуРНКазами)
9DsRBD
92 С-концевыхдоменаРНКазы III
9Коннекторнаяальфа-спираль
(рулер) (положительно заряжена)
9ATФазный/геликазный домен
DExD/H (неу всех)
9DUF (Domain of Unknown Function) (неу
всех) (“платформа”?)
Начальный слабый контакт с дцРНК (и оцРНК!), белокбелковые взаимодействия
Второй контакт с дцРНК, прочное связывание
Расщепление дцРНК с последующим
высвобождением одной цепи
Определяет расстояние между сайтами разрезания
Более легкоекое высвобождениевысвобождение продукта, транслокациятранслокация DICERDICER?? Не показанана геликазнаягеликазная
активностьь!!
TRBP - TAR RNA Binding Protein, необходимый кофактор Dicericer ((уу DmDm –– R2D2)R2D2)
Кристаллическая структура DicerDicer
Ruler – определяет длину продукта! Объект искусственного мутагенеза DICER
65Å = 25 п.н.
MacRae IJ et al. Structuralral BasisBasis forfor DoubleDouble-- Stranded RNA processingng byby DicerDicer.. ScienceScience
2006
Домены Dicer |
Сам Dicer |
эволюционно |
Dicer |
эволюционноционно |
|
консервативны: |
консервативен: |
|
вативен: |
Zhang H et al. Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell 2004
Удрожжей, Neurosporaora ии DrosophilaDrosophila ––
выявленопо 2, у растенийстений додо 4,4, уу млекопитающих -1
Могутприсутствоватьдомены, ответственные заядерную локализациюлокализацию