Подготовка у универсиаде 2012 / РНК интерференция
.pdf
Короткиедвуцепочечные РНКРНК::
ключевой компонентизученных вариантов РНК-интерференциитерференции!!
21-34 (чащенеболее 25) (п.)н., общие особенностии структурыструктуры.. Восновепринципадействия – комплементарное взаимодействие сгомологичными последовательностямиьностями -- мишенями
Классификация этихРНКнаходитсяв стадиидии формирования иоснованананескольких параметрахпараметрах::
происхождениеРНК (экзогенное/эндогенное ипр.) способ процессинга биологический эффект
постоянно открывают новыеформы этих РНК, новыеые биологические эффекты иновыемеханизмы их реализацииализации
Малыерегуляторные РНКНК::
наиболееизученыдва основныхх типатипа
микроРНК (miRNA) |
малые интерферирующиеерирующие |
кодируются эндогенными |
РНК (siRNA) |
генами |
восновном экзогеннойенной природыприроды |
предшественники – |
предшественникии -- дцРНКдцРНК |
шпилечныеРНК |
более 30 пн |
одна miРНК действуетна |
могутбыть специфичныифичны кк |
множество мишеней |
одноймишени |
Источники вклетке, механизмы процессинганга испособырегуляции чрезвычайно разнообразныазны!!
Числопубликацийв PubMed смомента открытияРНК-интерференциинтерференции
В ядре В цитоплазме*
Основные (“канонические”) активности короткихоротких двуцепочечных регуляторныхРНК::
Пост-транскрипционноерасщепление мРНК-мишени (“классическая” РНКi):
условие – высокаягомологияс мишенью
Репрессиятрансляции мРНК; гомология с мишеньюнедолжна бытьполной
*по новымданным, могутпроисходитьи вядре
Транскрипционный сайленсинг хроматинас модификацией его ДНК
ДляиндукцииРНК-интерференции нужнажна дцРНКдцРНК!!
достаточнойдлины (убеспозвоночных - обычно болееболее 500500 пнпн))
ТранскрипцияРНКв |
Транскрипция сс |
||
результате |
|
инвертированныхых |
|
активности RdRP |
повторов |
||
Искусственная |
Вирусная |
Антисмысловаясмысловая |
|
инфекцияи |
|||
siРНК |
репликация |
транскрипциянскрипция |
|
Специфичнаядеградация РНК--мишенимишени
Индукция RNAi длинной дцРНК характерна (только?) для растений и беспозвоночных У позвоночных длинная дцРНК>30 пн запускает систему интерферонового ответа
СпособыискусственнойиндукцииРНК-интерференцииеренции зависятотобъектаисследования!
С.elegans
Drosophila
ЭСК, ооциты, ранниеэмбрионы
Дифференцированные клетки вкультуре, взрослые организмы in vivo
Кормление бактериктериямиями –– продуцентамими дцРНКдцРНК
Вымачиваниевание
в растворее дцРНКдцРНК
Инъекцияя дцРНКдцРНК
Трансгенез ((введениевведение
конструкции, транскрибирующейсякрибирующейся
собразованиемРНК-шпилькишпильки илиили дцРНКдцРНК))
Трансфекцияия дцРНКдцРНК
Трансфекция синтетическтетическойой sisiРНКРНК
Трансфекция плазмидойплазмидой,,
транскрибирующейсярующейся
собразованием РНКРНК--шпилькишпильки))
Оверэкспрессия комплементарнойлементарной оцРНКоцРНК
трансгена или вирусногорусного векторавектора (через механизмм коко--супресиисупресии))
Растения
Конец 1990х – начало 2000хгг..
Синтетическая мРНКподвергается специфической АТФ-зависимой деградациидеградации вв бесклеточныхсистемахэкспрессии вбесклеточныхсистемах экспрессииссии ((напримернапример,, эмбриональном экстракте Drosophila) придобавлении гомологичной дцРНКдцРНК--индуктораиндуктора
Преинкубация дцРНКсэкстрактомпереддобавлениеммРНК значительнотельно усиливаетусиливает эффект ! Чемпродолжительнее инкубация, темменьшее количествоо индуктораиндуктора
необходимо. Приинкубациипроисходитусилениесигнала
Экстрактыэмбрионов |
Длина индуктора: |
|
|
|
|
|
|
Drosophila, |
49 |
пн. |
KK-- |
инкубированные с |
|||
равномерномеченой |
149 |
пн. |
|
дцРНК (слеванаправо - |
505 |
пн. |
|
0, 15, 30 или 60 минут |
997 |
пн. |
|
инкубации) |
|
|
|
22 н
Вэкстрактахприсутствуеткакой-тофактор, который расщепляетпляет любуюлюбую длиннуюдвуцепочечную РНКсобразованиемкоротких дцРНКРНК
Количествоэтогофактораограничено, ипри значительномм избыткеизбытке негомологичной дцРНК (~200) эффектрасщепления мишенини исчезаетисчезает
Общаясхема “классической” РНК-интерференцииеренции
ДлиннаяДлинная |
дцРНКдцРНК |
Dicer |
Dicer |
Dicer |
Dicer |
Dicer |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ATP |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
КороткиеКороткие |
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
дцРНКдцРНК |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
РНК - RISC мишень
РасщеплениеРасщепление ии дальнейшаядальнейшая деградациядеградация клеточнымиклеточными нуклеазаминуклеазами
Организация siРНК
Дуплекс 19 пн
3’
3’
3’ оверхэнги 2 н.
без оверхэнгов неактивна!
¾3’ концеваяОНгруппа – необходимадляпраймирования припри образованииобразовании вторичных siРНК
¾5’ концеваяфосфатнаягруппа – необходимадля эффективнвногоого слайсингаслайсинга
Короткие оверхэнги с 3’ ОНгруппой и 5’ фосфатнойй группойгруппой –– типичный результат расщепления РНКазами типа IIII ((55’’ фосфатфосфат может быть добавлен специфической киназой)
Stefan Weitzer & Javier Martinez. The human RNA kinase hClp1 is active on 3′ transfernsfer RNARNA exonsexons and short interfering RNAs. Nature 2007
JenniferJennifer AA.. DoudnaDoudna
МеханизмРНКинтерференции: I стадияия ––
дайсинг (dicing)