Подготовка у универсиаде 2012 / РНК интерференция
.pdf
Косупрессия трансгенов оказалась типичной и для других объектов!
1995-1999: N.crassa (“Quelling”), планарии, трипаносомы, Zebrafish, C.elegans..
Наблюдения:
9Экспрессия трансгена часто приводит к сайленсингу самого трансгена, а также его эндогенного гомолога
9Введение генетических конструкций, направленных на усиленную экспрессию, приводили к более сильному эффекту сайленсинга
9Сайленсинг сопровождается деградацией мРНК подавляемого гена – является посттранскрипционным
9Наиболее эффективными оказываютсятрансгены, образующиеобразующие инвертированные повторы
Косупрессия трансгенов оказалась типичной и для других объектов!
1995-1999: N.crassa (“Quelling”), планарии, трипаносомы, Zebrafish, C.elegans..
Длятрансгенов былохарактерно встраиваниеввиде тандемных повторов
Еслисайленсингвызвантранскрипциейтрансгена, можноо лили моделироватьеговведениемсоответствующейРНК? Можетлиподобныйсайленсингдействовать без участияя трансгеновтрансгенов??
Наблюдения:
Сходные эффекты вызывают дцРНК содержащие вирусы растений, имеющие в геноме участки гомологии с генами хозяина
Если введение трансгена само по себе не приводило к косупрессии, она могла индуцироваться введением в трансгенные растения реплицирующегося вируса, содержащего гомологичную последовательность
Гипотеза: супрессия трансгенов вызвана антисенс-ингибированием?
|
|
|
Рибосомы |
Guo, Kemphues (199595)):: |
||
|
|
|
|
|
|
механизм подавленияния экспрессииэкспрессии |
|
|
|
|
|
3’ polyA |
можетне объяснятьсяться простымпростым |
5’ cap |
|
|
спариваниемс мРНКК--мишеньюмишенью!! |
|||
|
|
|
|
|||
Инъекция антисмысловой РНК вызывала сайленсинг эндогенного гена par-1, но инъекция смысловой РНК давала тот же эффект! (работа на C.еlegans)
Нодляподавления
экспрессиинетребуется многокопийРНК!
ОткрытиеРНК-интерференции (1998)1998)
Признак: подавлениеэкспрессиигенагена Unc-22 у C. elegans:gans: мутантныймутантный фенотип = нескоординированные судороги (twitching)
Воздействиенапризнак: инъекции синтетическихРНК, соотвеответствующихтствующих иликомплементарныхРНК-копиямразличныхэкзонов
ОткрытиеРНК-интерференциии
Введениесинтетическойсмысловойиантисмысловой РНКК,, соответствующейматричной, сопровождалась деградациейией соответствующеймРНКипоявлением мутантного фенотипатипа вв F1F1
Рабочая гипотеза: сайленсинг после введения смысловой либо антисмысловой РНК обусловлен примесями двуцепочечной РНК!
9дцРНКоказаласькакминимум в 10 разболее эффективнаа,, чемчем оцРНКоцРНК 9очисткаотдцРНКпривелакисчезновениюсайленсинга прири введениивведении смысловыхиантисмысловыхРНК!
9дляэффектадостаточнонесколькихмолекулдцРНКна клеткулетку –– нестехиометрическийэффект, требуетсямеханизм усиленияия сигналасигнала
Антисмысловая исмысловаяРНКдляиндукции РНК-интерференцииции могутмогут бытьбыть инъецированы раздельно, хотя неболее, чем счасовым интерваломлом
Fire et al. Nature (1998)
СвойстваРНК-интерференцииции--11
(к 1998 г.)
9ДцРНКдействуетвкрайненизких концентрациях→→ механизммеханизм действия неможетбытьобъясненпростым спариваниеманием сс мишенью
9Эффективна только дцРНК, гомологичная экзонам генаена,, экспрессияэкспрессия
которого подавляется; инъекциясегментов, соответствующихствующих промоторамиинтронам, неприводит к интерференциинции
9Эффектрепрессиипадаетсуменьшением размераа дцРНКдцРНК
9Добавление негомологичной дцРНК снижает активностьвность подавленияэкспрессии
9Эффектрепрессииможетнаследоваться
9ПриРНК-интерференции снижаетсясодержание цитоплазматической мРНК, нонеядерных предшественниковвенников→→ РНК-интерференциядействует посттранскрипционнонно
Подтверждение посттранскрипционногоо эффектаэффекта РНК-интерференции у C.elegansns
гибридизация меченогозонда c мРНК гена Mex-33 inin situsitu
(локализуетсявгонадахразвивающегося эмбрионаиона))
а) отрицательный |
b) эмбрион взрослогоослого родителяродителя сс |
контроль (без зонда) |
нормальной экспрессиейспрессией mex3mex3 |
Fire et al. Nature (1998)
с) эмбрионпослеинъекции родителю |
d) эмбрион послеосле инъекцииинъекции |
антисмысловой РНКк mex3 – уровень |
родителю дцРНКРНК кк mex3mex3 –– |
экспрессии mex3 снижен |
нет экспрессииии mex3mex3 |
РНК-интерференция может распространятьсяаняться попо организмуинаследоватьсяв поколенияхениях!!
Вопрос: пересекаетлидцРНКграницыклеток? Наследуетсяя лили эффектэффект уу потомства?
Методы: использовали линию C.elegans, меченую репортернойрной конструкцией gfp:lac-z
ВведениедцРНКкгену gfp иликгену lacZ вызывает специфичныйфичный сайленсингрепортернойконструкции gfp:lacZ (регистрируемыймый попо экспрессии GFP вразных типахклеток)
b- дефектны по системе интерференции
Результат: При инъекции дцРНК к gfp или lac-z в полостьь телатела ((сс головыголовы или хвоста) интерференция наблюдалась в гонадах потоотомствамства.. КогдаКогда проводили инъекцию молодым особям, обнаруживали эффектфект вв гонадахгонадах ии полости тела, когда черви вырастали во взрослых. Должен бытьбыть механизммеханизм
транспорта сигнала!
Fire et all.. NatureNature (1998)(1998)
РНК-интерференция может распространятьсяаняться попо организмуинаследоватьсяв поколенияхениях!!
GFP экспрессировался вдвух вариантах – ядернаяи митохондриальнаяхондриальная локализация
На фотографиях видно свечение GFP
Слева: потомство животных, которым была инъецирована контрольная дцРНК ds- unc22А
а) личинка б)зрелая особь
с)тело зрелой особи при высоком увеличении
Справа: потомство животных, которым была инъецирована дцРНК ds-gfpG. Немногочисленные клетки, в которых сохранилась экспрессия GFP, сохраняли ее и в ядре, и в митохондриях
масштаб 20 мкм
Fire et al. NatureNature (1998)(1998)
СвойстваРНК-интерференцииции--22
9ПриРНК-интерференции происходитдеградация РНКНК--мишенимишени
9ПриРНК-интерференции происходитрасщепление дцРНКдцРНК-- индуктора
9СкоростьрасщеплениядцРНК-индуктора коррелируетует сосо скоростьюдеградацииРНК-мишени (и, соответственнонно,, скоростьюскоростью подавленияэкспрессиигомологичного гена)
9ПрирасщеплениидцРНК-индуктораобразуются короткиеоткие фрагменты одинаковой длины, которыетакжемогут вызыватьвызывать
РНК-интерференцию; последеградациимикрококковой нуклеазойазой способностьспособность вызывать РНК-интерференциюисчезает
Этикороткиедвуцепочечные фрагменты запускаютпускают механизмспецифической деградацииРНК-мишенимишени
ПодобныеимкороткиедцРНК образуются воо многихмногих,, еслиневовсехвысшихорганизмах и участвуютвуют вв
регуляцииэкспрессииихгенов