МЕРКУРИРОВАНИЕ
•Широко распространенная в органической химии реакция непредельных соединений с ацетатом ртути в случае нуклеиновых кислот проходит в мягких условиях (вода, рН 6.0-7.0, 40-50 0С). Результатом реакции является образование производных 5-ацетоксимеркуриоурацила и 5- ацетоксимеркуриоцитозина. 5- Меркуриопроизводные вследствие легкого обмена атома ртути на атомы галогена или трития используются для получения специфически меченных пиримидиновых оснований нуклеиновых кислот.
21
МЕРКУРИРОВАНИЕ
22
|
Hg(OAc)2 |
|
CH2=CH-CH2N+H3OAc |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
K2PdCl4 |
|
|
O |
||||||||
|
0.1 M NaOAc |
|
|
|
|||||||||
|
pppdUHgCl |
0.1 M NaOAc, pH 5.0 |
pppdUCH=CH-CH2NH2 |
|
|
|
|
|
|
||||
|
pH 5.0 |
|
|
|
|
|
|
||||||
pppdU |
R Suc |
||||||||||||
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
||||||||||
2. LiCl |
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CH=CH-CH2NH |
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
C |
|
R |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
HN |
|
|
|
|
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O |
|
|
O |
|
O |
|
|
O |
|
|
N |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
-O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
P |
|
O |
|
|
P |
|
O |
|
P |
|
O |
|
|
|
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O- |
|
|
O- |
|
O- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
OH |
|
H (OH) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
R = |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
F |
|
|
|
N3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N |
|
|
|
|
|
|
|
N3 |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O2N |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
(171d), |
(171r) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(173r) |
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||
|
|
|
(172d), (172r) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||
23
Введение фотоактивируемых групп в ДНК-зонд
• Фотоактивируемый аналог dUTP |
|
|
O |
|
CH2=CH-CH2NH |
|
O |
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
C |
|
F |
|
|
N3 |
|||||||||||||||||||||||
|
|
O |
|
O |
|
|
O |
|
|
|
HN |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
-O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O N |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
P |
|
O |
|
P |
|
O |
|
P |
|
O |
|
|
O |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
O- |
|
O- |
|
|
O- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
OH |
H |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
**** Зонд |
dNTP |
**** R R |
ДНК |
+ |
|
pppdUR |
|
|
Гибридизация |
|
Элонгация |
h
*
*
*
*
Детекция |
Фотоприсоединение |
24
Двухступенчатая гибридизация in situ
(д.ф.-мат.н. А.И. Полетаев)
25
Мечение нуклеиновых кислот
•Поиски эффективных нерадиоактивных маркеров, пригодных для мечения зондов, привели к созданию как минимум двух альтернативных меток: биотин- dNTP (bio-dNTP, фирмы Sigma и Gibco-BRL) и дигоксигенин-dUTP (dig- dUTP, фирма Boehringer Mannheim).
26
Производные нуклеиновых кислот, снабженные дигогсигениновой меткой
•Использование в качестве метки дигоксигенина, обеспечивает большую специфичность и
воспроизводимость, а чувствительность метода близка к таковой для случая радиоактивно меченных зондов. Дигоксигенин присутствует только в растении дигиталис (наперстянка), что уменьшает неспецифичное окрашивание, обусловленное взаимодействием с эндогенными соединениями.
27
28
«ПОДВОДНЫЕ КАМНИ»
•При работе с аллиламином и его производными могут протекать «незапланированные» реакции по С-4 положению гетероцикла.
29
O
O |
N |
|
|
HN |
H |
|
|
O N |
|
DMTr O
O
|
|
|
|
|
|
|
|
O |
CN |
||||
|
|
|
|
|
|
|
N |
|
P |
|
O |
||
|
|
|
||||
HN
N
O
N
CF3 |
|
H2N |
|
O |
NH2 |
|
|
HN |
|
|
|
|
|
NH2 |
|
O N |
|
|
|
|
|
|
|
О лиго н уклео тид |
|
|
|
|
|
O |
O |
|
|
|
|
|
O |
N |
N |
|
HN |
H |
H |
|
|
|
|
|
O N |
|
NH2 |
О лиго н уклео тид
О лиго н уклео тид
90-95%
30