Химико-ферментативный синтез ДНК

pCpTpGpCpApG GpApCpGpTpCp

3

pCpTpGpCpApG pCpTpGpCpApG GpApCpGpTpCpGpApCpGpTpC

Модификация по сахаро-фосфатному остову

•Более 40 антисмысловых олигонуклеотидов и их аналогов находятся на различных стадиях доклинических и клинических испытаний, и более половины из них представляют собой фосфоротиоаты. К настоящему времени допущено на фармацевтический рынок США лекарство VitraveneTM, которое представляет собой 21-звенный фосфоротиоат [Yan. J. Chem. Perkin Trans.2002]. Однако, как стало известно от А.Г. Веньяминовой, на данный момент использование данного препарата запретили.

Тиофосфатные олигонуклеотиды

Тиофосфатные олигонуклеотиды

• Тиофосфатные олигонуклеотиды — это

модифицированные олигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода в фосфатном остатке замещен на атом серы. Широко используются только те тиофосфаты, в которых сера не является связующим звеном между нуклеозидным остатком и атомом фосфора. В этом случае замена кислорода на серу приводит к образованию нового центра хиральности на атоме P(V), поэтому в простейшем случае динуклеотида

образуются SP- и RP-диастереомеры. В n-мерном олигонуклеотиде, в котором все (n-1) межнуклеотидных связей являются тиофосфатными, число диастереомеров составляет 2(n-1).

Тиофосфатные олигонуклеотиды

•Будучи неприродными аналогами нуклеиновых кислот, олигонуклеотидные тиофосфаты значительно более устойчивы к гидролизу нуклеазами. Это свойство определяет использование тиофосфатов в качестве антисмысловых олигонуклеотидов в приложениях in vivo, где неизбежно воздействие нуклеаз. Подобным образом, чтобы увеличить стабильность в малых интерферирующих РНК, часто вводят, по крайней мере, одну тиофосфатную связь в 3'-положение смысловой и антисмысловой цепи. В оптически чистых олигонуклеотидных тиофосфатах диастереомеры, в которых все фосфорные центры имеют SP- конфигурацию, более устойчивы к ферментативному гидролизу, чем их RP-аналоги. Однако, синтез оптически чистых тиофосфатов сложен. В лабораторной практике обычно пользуются смесями диастереомеров.

Получают амидофосфитным методом на твердой фазе; модифицированным Н-фосфонатным методом. Стадия окисления заменяется реакцией сульфурирования. Кэпирование проводится после сульфурирования. 3-(Диметиламинометилиденамино)-3H- 1,2,4-дитиазол-3-тион (DDTT) обеспечивает высокую скорость сульфурирования и обладает стабильностью в растворе. Реагент Бокажа (Beaucage Reagent) имеет более высокую растворимость в ацетонитриле и обеспечивает протекание реакции за более короткое время. Однако, он имеет ограниченную стабильность в растворе и менее эффективен при сульфурировании связей РНК

Морфолиновые аналоги моно- и олигонуклеотидов

•Диметиламиноморфолидофосфатные аналоги олигонуклеотидов - одни из самых успешных в области регуляции экспрессии генов с точки зрения эффективности синтеза, растворимости в воде, способности образовывать комплементарные комплексы с природными НК. Хотя в них имеется дополнительный хиральный атом фосора, вследствие чего олигомеры такого типа представляют рацемическую смесь 2n диастереомеров, где n –число фосфатных групп. В настоящее время некоторые антисмысловые морфолиновые аналоги проходят клинические испытания.

Bn

Bn+1

N O

N(CH3)2