•Стадия 3. Кэпирование.
•Проводится путём обработки твердофазного носителя смесью уксусного ангидрида и 1-метилимидазола (реже – N,N- диметиламинопиридина) в качестве в качестве катализатора. В рамках амидофосфитного синтеза эта стадия служит двум целям: 1) После завершения стадии конденсации небольшая доля 5'- гидроксильных групп (0,1-1 %) остаётся непрореагировавшими и должна быть выведена из процесса дальнейшего удлинения цепи, чтобы предотвратить образование олигонуклеотидов с недостающими нуклеотидныим остатками внутри цепи. С этой целью оставшиеся гидроксильные группы защищаются ацетильными группами, устойчивыми к действию растворов кислот, используемых для снятия DMT-защиты. 2) Сообщалось также, что амидофосфиты, активированные 1H-тетразолом, с невысоким выходом реагируют с кислородом карбонильной группы в O6-положении гуанозина. При окислении смесью I2/вода этот побочный продукт претерпевает отщепление пуринового основания. Образующиеся апуриновые сайты легко гидролизуются в ходе конечного снятия защитных групп олигонуклеотида, что приводит к образованию двух более коротких олигонуклеотидов и уменьшению выхода целевого продукта. O6-модификации быстро удаляются под действием кэпирующего реагента, если кэпирование проводится перед стадией окисления.
•Стадия 4: Окисление
•Полученная в результате конденсации межнуклеозидная трехкоординированная фосфитная группа не является природной и обладает ограниченной стабильностью в условиях синтеза. Обработка носителя йодом и водой в присутствии слабого основания (пириди) окисляет фосфит в фосфотриэфир, предшественник природной фосфодиэфирной межнуклеозидной связи.
Наиболее часто употребимыми носителями являются CPG (controlled pore glass, стекло с регулируемым размером пор) и MPPS (макропористый полистирол).
•Главной характеристикой CPG является размер пор. Для синтеза олигонуклеотидов длиной около 50, 80, 100, 150 и 200 оснований пользуются стеклом с размером пор 500, 1000, 1500, 2000 и 3000 Å соответственно. Для того, чтобы сделать такой носитель пригодным для синтеза, его обрабатывают (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES), получая аминопропильное CPG. Аминопропильный спейсер может быть существенно удлиннён; полученные таким образом носители называют LCAA (long chain aminoalkyl) CPG. Аминогруппа на поверхности стекла далее используется как якорная группа для различных линкеров, используемых в химии олигонуклеотидов.
•MPPS, используемый в синтезе олигонуклеотидов, - это слабонабухающий полистирол с высокой степенью сшивки, получаемый сополимеризацией дивинилбензола (минимум 60 %), стирола и 4-хлорметилстирола в присутствии порогенного агента. Получаемый при этом макропористый хлорметильный полистирол затем превращают в аминометильный MPPS.
Синтез лучше протекает на ненабухающих или
слабонабухающих твердофазных носителях.
Носители 1 и 2 – универсальные; 3 – нуклеозидный; 4 - специальный
Универсальные носители
Ссылка по просьбе
•Universal Solid Supports for the Synthesis of Oligonucleotides via a Transesterification of H- phosphonate Diester Linkage
•Fernando Ferreira , Albert Meyer , Jean-Jacques Vasseur , and François Morvan
•Laboratoire de Chimie Organique Biomoléculaire de
Synthèse, UMR 5625 CNRS-UM II, ERT “Oligonucleotides: Methodologie Valorisation”, Université de Montpellier II, CC008, Place E. Bataillon, 34095 Montpellier Cedex 5, France
•J. Org. Chem., 2005, 70 (23), pp 9198–9206
•DOI: 10.1021/jo051172n
Универсальные носители
•В более удобном методе синтез начинается с универсального носителя, к которому присоединён ненуклеозидный линкер. Амидофосфит, соответствующий 3'-терминальному нуклеозиду, присоединяется к универсальному носителю по стандартной методике в ходе первого синтетического цикла. Затем продолжается сборка требуемой последовательности, после чего олигонуклеотид снимается с поверхности носителя. Характерной особенностью универсальных носителей является то, что отщепление олигонуклеотида происходит путём гидролиза связи P-O, соединяющей 3'-O-атом 3'-терминального олигонуклеотида с универсальным линкером. Преимущество данного подхода заключается в том, что единственный универсальный носитель может быть использован во всех синтезах независимо от того, какую последовательность необходимо синтезировать.
Гидролиз Р-О связи при отщеплении от универсального носителя
Нуклеозидные носители
•В исторически первом, хотя и менее популярном в настоящее время подходе, синтез олигонуклеотида проводится на носителе, к которому заранее, через фрагмент янтарной кислоты, ковалентно присоединён 3'-концевой нуклеозид. Соответственно, синтез начинается с присоединения амидофосфита, соответствующего не первому, а второму нуклеотиду, считая с 3'- конца. Недостатком такого носителя является то, что для синтеза определённого олигонуклеотида необходимо выбирать конкретный вариант нуклеозидного носителя, что уменьшает производительность синтетического процесса и увеличивает вероятность человеческой ошибки.
Специальные носители
• используются для присоединения
некоторой функциональной или репортерной группы к 3'-положению синтетических олигонуклеотидов. Коммерчески доступны носители для введения аминогрупп, меркаптогрупп, тушителей флуоресценции и др.