ХИМИЧЕСКИЙ И ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ НЕПРИРОДНЫХ АНАЛОГОВ
•Методы образования фосфодиэфирной связи: химические и ферментативные методы синтеза. Фосфодиэфирный и фосфотриэфирный методы синтеза олигонуклеотидов. Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов (амидофосфитный вариант). Н-фосфонатный синтез олигорибонуклеотидов.
В 1950-х гг. Корана и сотрудники разработали фосфодиэфирный метод, в котором 3'-O-ацетилнуклеозид-5'-O- фосфат активировался N,N'-дициклогексилкарбодиимидом (DCC) или п-толуолсульфонилхлоридом (TsCl), а затем вводился в реакцию с 5'-O-защищённым нуклеозидом с образованием динуклеозидмонофосфата
Фосфодиэфирный метод
•С использованием фосфодиэфирного метода были синтезированы наборы три-
итетрадезоксирибонуклеотидов, которые затем были превращены в более длинные олигонуклеотиды, позволившие расшифровать генетический код. Главным ограничением метода является образование пирофосфатных олигомеров
иолигонуклеотидов, разветвлённых у межнуклеозидной фосфатной группы. Отсутствие удобной стратегии защиты потребовала отказа от данного метода.
Фосфотриэфирный метод синтеза.
В 1960-х гг. под руководством Р. Летсингера (R. Letsinger) и К. Риза (C. Reese) был разработан фосфотриэфирный метод.
Определяющее отличие от фосфодиэфирного подхода состоит в предварительной защите фосфата в реагенте и продукте цианэтильной группой.
TPSCl – триизопропилбензолсульфохлорид.
Фосфотриэфирный метод синтеза
•Предварительная защита фосфата в реагенте и продукте цианэтильной группой исключила возможность образования олигонуклеотидов с разветвлением у фосфатных групп. Боольшая селективность метода позволила использовать более реакционноспособные конденсирующие реагенты и катализаторы, которые значительно уменьшили продолжительность синтеза. Метод, изначально разработанный для синтеза в растворе, был также применен и в твердофазном синтезе, первоначально на полистироле с низкой степенью сшивки, что инициировало широкий научный поиск в твердофазном синтезе олигонуклеотидов и в конечном итоге привело к автоматизации синтеза.
Для защиты A, dA, C и dC используется бензоильная защита (Bz), тогда как G и dG защищаются изобутирильной группой. Позже для защиты C и dC была предложена ацетильная (Ac)
группа, которая может быть удалена и аммиаком, и, существенно быстрее, смесью аммиака с метиламином. Фосфитная группа защищается 2-цианэтильной группой.
В синтезе РНК, 2'-гидроксильную группу защищают трет- бутилдиметилсилильной (TBDMS) или триизопропилсилилоксиметильной (TOM) группой. Обе группы удаляются действием фторид-иона.
Фосфитная группа также содержит диизопропиламинную группу (i-Pr2N), реакционноспособную в кислых условиях. При активации путем протонирования эта группа замещается 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида, иммобилизованного на твёрдой фазе
Фосфитный триэфирный метод (амидофосфитный подход)
Этапы синтеза
•Стадия 1: Удаление тритильной защиты
•Защитная группа DMT снимается раствором кислоты, например, 2%-ой трихлоруксусной или 3%-ой дихлоруксусной кислотой в инертном растворителе (хлористый метилен или толуол). Образующийся диметокситритильный катион оранжевого цвета вымывается из системы. В результате образуется закреплённый на твердофазном носителе предшественник олигонуклеотида со свободной 5'- гидроксильной группой. Проведение процесса в течение более длительного времени или с использованием более концентрированных растворов кислоты приводит к отщеплению пуриновых оснований от остатка сахара.
•Стадия 2: Конденсация
•Раствор нуклеозидного амидофосфита (0,02-0,2 М) или смеси нескольких амидофосфитов в ацетонитриле активируют 0,2-0,7 М раствором катализатора на основе азола, например, 1Н-тетразола. Смешение компонентов происходит в коммуникационных линиях синтезатора в процессе доставки реагентов в реактор, содержащий твердофазный носитель. Активированный амидофосфит в 1,5-20- кратном избытке приводится во взаимодействие с исходным носителем (первая конденсация) или предшественником олигонуклеотида на носителе (последующие конденсации), 5'- гидроксильная группа которого реагирует с активированной амидофосфитной группой с образованием фосфитной триэфирной связи. Конденсация амидофосфитов 2'-дезоксинуклеозидов протекает очень быстро и в небольшом масштабе занимает, как правило, около 20 с. Пространственно-затрудненные амидофосфиты рибонуклеозидов реагируют значительно медленнее (5-15 мин). Реакция весьма чувствительна к присутствию воды, особенно при использовании разбавленных растворов амидофосфитов, поэтому она проводится в безводном растаорителе, обычно, ацетонитриле. При увеличении масштабов синтеза используют меньшие избытки и более концентрированные растворы амидофосфитов. После завершения реакции избыток реагентов и побочные продукты удаляются из реактора промыванием.