Автоматическое секвенирование ДНК по м.м. Сэнгера

В основе автоматического секвенирования лежит уже упоминавшийся выше метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP. Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии:

1. - проведение терминирующих реакций;

2. - разделение продуктов реакций с помощью электрофореза.

Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ или капилярных трубках, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое секвенирование идеологически отличается от современного ему ручного секвенирования только типом используемой метки.

Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам:

I. меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторы; II. меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы;

III. меченные терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер.

Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на одной дорожке. 23

Сравнение методов секвенирования по Сэнжеру и Максаму-Гилберту

Метод Максама-Гилберта и метод Сэнгера основаны на одном принципе. В первом используется специфическое расщепление ДНК, обусловленное природой оснований, во втором - статистический синтез ДНК, заканчивающийся на каком-либо одном из 4 нуклеотидов. Таким образом, основой обоих методов является получение полного (статистического) набора фрагментов ДНК, оканчивающихся на каждом из четырех нуклеотидов.

Химический метод (метод Максама-Гилберта) проще использовать в том случае, когда исследуемая ДНК не слишком велика (200-500 звеньев). В том случае, если речь идет о секвенировании высокомолекулярной ДНК, лучше применять метод полимеразного копирования (метод Сэнгера), чтобы не вводить процедуру рестриктазного расщепления с выделением индивидуальных фрагментов. При энзиматическом секвенировании протяженных одноцепочечных ДНК (например, бактериофагов) можно применять набор олигонуклеотидов-затравок, синтез которых не требует больших затрат времени и труда. Для двуцепочечных высокополимерных ДНК наиболее удобен метод слепого энзиматического секвенирования с применением универсальных праймеров и обработки данных с помощью ЭВМ либо с использованием методов поэтапного секвенирования либо «прогулки по хромосоме». Химический метод также

25

Из истории разработки техники быстрого секвенирования

С попыткой создать технику быстрого чтения ДНК познакомил своих читателей журнал Nature (2005, т. 437, с. 376–380). Новый метод секвенирования описали несколько десятков авторов под руководством Марселя Маргулиса и Майкла Эгхольма (Marcel Margoulies, Michael Egholm) из «454 Life Science Corporation» в Коннектикуте. Кроме этой компании в работе участвовали Калифорнийский университет, Рокфеллеровский университет и Ротберговский институт детских болезней. Имя Джонатана М. Ротберга в списке авторов стоит последним (как фамилия руководителя работы), тем не менее новый метод уже называют «секвенированием по Ротбергу». Основатель корпорации «CuraGen», одной из ведущих компаний в области фармакогенетики, знаменит не только научными достижениями, но и тем, что регулярно попадает в списки самых молодых среди богатых и самых богатых среди молодых жителей планеты — сейчас ему чуть больше сорока лет. Однако разработка супербыстрого секвенирования была для него не только перспективным вкладом денежных средств.

Такие трогательные истории чаще происходят в голливудских научно- фантастических фильмах, но иногда случаются и в жизни. Когда у Ротберга родился сын, он и сразу же попал в отделение интенсивной терапии: мальчик не мог самостоятельно дышать. Отец не спал ночей от беспокойства, подозревая у ребенка генетическую болезнь. Молодые папы вообще склонны к панике, но доходы Ротберга позволяли ему паниковать с размахом. Он пообещал себе, что расшифрует весь геном

Из истории разработки техники быстрого секвенирования

Сравнение методов секвенирования по Сэнгеру и по Ротбергу

21

3

28

Принцип метода пиросеквенирования

Берется образец ДНК, которую надо прочитать. Специальные ферменты нарезают его на кусочки случайным образом, и кусочки эти изолируют друг от друга предельным разведением. К каждому кусочку прикрепляют адапторную нуклеотидную последовательность, которая, в свою очередь, заякоривается на маленькой бусинке (средний диаметр — 28 микрометров). К одной бусинке прикрепляется только один фрагмент. Затем бусины попадают в капельки водной эмульсии в масле. В этих капельках содержится все необходимое для амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР): каждая капелька — это отдельный реакционный сосуд, в котором копируется один и только один фрагмент ДНК. Как сказал журналистам сам Ротберг, при традиционном для метода Сэнгера клонировании фрагменты ДНК изолируют и наращивают в бактериальных клетках, а здесь роль клеток играют капельки эмульсии. После ПЦР к каждой бусинке прицепляется около 10 млн. копий индивидуального фрагмента. Эмульсию разрушают, и бусинки, обросшие ДНК, центрифугированием загоняют в реакционные сосуды — открытые сверху микроскопические соты (диаметр каждой ячейки 44 микрометра, объем — 75 пиколитров). Соты размещены на волоконно-оптической подложке — квадратике размером 6 на 6 см, который несет на себе примерно 1,6 миллиона ячеек. Если бусина попадет не в каждый «колодец», это даже хорошо: меньше будет29

вероятность ложных сигналов.

Принцип метода пиросеквенирования