1

Предпосылки возникновения методов секвенирования

В отечественной литературе методы расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот принято называть методами секвенирования.

Следует обратить внимание на правильность написания терминов: сЕквенирование нуклеотидной последоватильности но сИквенс гена.

Еще в 50-е годы прошлого века были разработаны методы, позволяющие определять последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Теоретически это несложно, поскольку все аминокислоты, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. Поэтому, когда был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако, генетический код является вырожденным. Следовательно, первичная структура ДНК, полученная на основе анализа последовательности аминокислот, не является однозначной. Кроме того, для эукариот таким способом можно восстановить лишь нуклеотидный состав экзонов, тогда как информация о составе интронов теряется в результате сплайсинга. 3

4

Основные принципы секвенирования по Максаму и Гилберту

В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. В 1977 г. Максамом и Гилбертом был предложен метод секвенирования, основанный на селективной химической модификации различных типов гетероциклических оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований проводятся таким образом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем модифицировалось только одно звено данного типа. Поскольку все звенья данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажется частично модифицированным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению модифицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах отщепления гетероциклов.

Модификации подвергают ДНК, 32Р-меченные по 5'-концевому нуклеотидному звену. Радиоактивная метка вводится фосфорилированием с помощью 32Р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы.

5

Основные принципы секвенирования по Максаму и Гилберту

Фрагмент ДНК

Модификация азотистого основания

Отщепление или замещение модифицированного основания

Разрыв сахаро-фосфатной цепи ДНК

Отщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработки вторичным амином или щелочью.

Таким образом, в результате химической деградации получается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментов соответствуют положению мономерных звеньев того типа, который подвергался модификации. Концевая радиоактивная метка служит точкой6

отсчета при определении длины продуктов химической деградации ДНК.

Основные принципы секвенирования по Максаму и Гилберту

Химическая деградация ДНК

Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ, который позволяет разделять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК читается непосредственно с радиоавтографа геля.

Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной структуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 – 16 звенных) олигодезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае реакции химической модификации проводят в более жестких условиях (увеличивая время и температуру реакции) с целью повышения степени модификации7 .

Основные принципы секвенирования по Максаму и Гилберту

Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям определенного типа достаточно велик и постоянно пополняется:

по остаткам гуанина – обработка диметилсульфатом; по остаткам аденина и гуанина – апуринизация 50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону);

по остаткам аденина и цитозина – расщепление гетероциклических оснований под действием 1,2 Н NaOH;

по остаткам тимидина и цитозина – обработка гидразином.

В настоящее время широко используются два основных варианта секвенирования по Максаму — Гилберту. В первом из них реакции химической модификации ДНК проводят в растворе, а во втором ДНК предварительно иммобилизуют на твердой фазе (например, ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод более традиционен, его многочисленные модификации с успехом использовались для секвенирования фрагментов ДНК различных размеров, в том числе олигонуклеотидов. В то же время второй метод имеет ряд преимуществ. Он менее трудоемок и занимает меньше времени, проще в освоении, позволяет обойтись минимальным набором оборудования. В целом оба метода обеспечивают получение вполне приемлемых результатов, а выбор одного из них определяется8

конкретными условиями лаборатории.

12