Тема 37. Возбудители туберкулеза

2

5.2.Факторы патогенности возбудителей туберкулеза.

5.3.Методы диагностики, профилактики и лечения туберкулеза.

6. Задания и методические указания к их выполнению.

На занятии студенту необходимо:

6.1.Ответить на вопросы преподавателя.

6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3.Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка Туберкулез – хроническое инфекционное заболевание, сопровождающееся

специфическим поражением различных органов и систем (органов дыхания, лимфатических узлов, кишечника, костей, суставов, глаз, кожи, почек, мочевыводящих путей, половых органов, ЦНС). При туберкулезе в органах образуются специфические гранулемы (granulum – зернышко) в виде узелков или бугорков (tuberculum – бугорок) с последующим их творожистым перерождением (распадом) и обызвествлением.

Историческая справка. С глубокой древности это заболевание было известно под названиями чахотка, бугорчатка, золотуха из-за характерных клинических признаков. Впервые отделил “чахотку” от других легочных заболеваний Лаэннек в 1819 г., он ввел термин “туберкулез” (отсюда синоним - бугорчатка). В 1882 г. Р. Кох обнаружил возбудителя туберкулеза и получил чистую культуру на сывороточной среде (палочка или бацилла Коха). В 1890 г. Р. Кох получил туберкулин (“водно-глицериновую вытяжку туберкулезных культур”). В 1911 г. Р. Кох за открытие возбудителя туберкулеза был удостоен Нобелевской премии.

Таксономия. Отдел Firmicutes, семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium.

Туберкулез у человека чаще всего вызывают три вида микобактерий: M. tuberculоsis (палочка Коха, человеческий вид - вызывает заболевание в 92% случаев), М. bоvis (бычий вид - вызывает заболевание в 5% случаев), М. аfriсаnum (промежуточный вид - вызывает заболевание в 3% случаев, в Южной Африке – намного чаще). В редких случаях туберкулез у человека вызывают M. microti (мышиный тип) и M. avium (птичий тип, вызывающий инфекцию у лиц с иммунодефицитом).

Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудители туберкулеза характеризуются выраженным полиморфизмом (кокковидные, нитевидные, ветвистые, колбовидные формы). В основном они имеют форму длинных тонких (М. tuberculosis, М. africanum) или коротких и толстых (М. bovis) палочек с зернистой цитоплазмой, содержащей от 2 до 12 зерен различной величины (зерна метафосфатов – зерна Муха). Иногда они образуют нитевидные структуры, напоминающие мицелий грибов, что и послужило основанием для их названия (mykes - гриб и bacterium - бактерия). Неподвижные. Спор не образуют. Имеют микрокапсулу.

Грамположительные. Микобактерии являются кислото-, спирто- и щелочеустойчивыми бактериями. Для их окраски применяют метод Циля-

3

Нильсена (термокислотное протравливание карболовым фуксином). При такой окраске микобактерии выглядят в виде ярко-красных палочек, расположенных одиночно или небольшими скоплениями из 2-3 клетки.

Культуральные свойства. Облигатные аэробы. Растут медленно из-за наличия в клеточной стенке липидов, замедляющих обмен веществ с окружающей средой. Оптимальная температура роста 37-38ºС. Оптимальное значение рН 6,8-7,2. Микобактерии требовательны к питательным средам, глицеринзависимые. Для подавления токсического действия образуемых в процессе метаболизма жирных кислот к средам добавляют активированный уголь, сыворотку крови животных и альбумин, а для подавления роста сопутствующей микрофлоры - красители (малахитовый зеленый) и антибиотики, не действующие на микобактерии.

Элективные питательные среды для микобактерий:

-яичные среды Левенштейна-Йенсена, Финна-2;

-глицериновые среды Миддлбрука;

-картофельные среды с желчью;

-полусинтетическая среда Школьниковой;

-синтетические среды Сотона, Дюбо.

На плотных средах на 15-20 день инкубирования микобактерии образуют шероховатые плотные колонии кремового цвета бородавчатого вида (напоминают

цветную капусту).

В жидких средах через 5-7 дней на поверхности образуется толстая сухая морщинистая пленка кремового цвета. При этом бульон остается прозрачным.

Для экспресс-диагностики используют метод микрокультивирования на стеклах в жидкой среде (метод микрокультур Прайса), при котором через 48-72 часа отмечается рост микобактерий в виде переплетенных девичьих “кос” или “жгутов” благодаря корд-фактору (англ. cord - жгут, веревка).

Химический состав. Основные компоненты микобактерий: белки (туберкулопротеины), углеводы и липиды.

Туберкулопротеины составляют 56% сухой массы вещества микробной клетки. Они являются основными носителями антигенных свойств микобактерий, высокотоксичны, вызывают развитие реакции гиперчувствительности 4-го типа.

На долю полисахаридов приходится 15% сухой массы вещества микобактерий. Это родоспецифические гаптены.

На долю липидов (фтионовая кислота, масляная, пальмитиновая, туберкулостеариновая и другие жирные кислоты, корд-фактор и воск Д, в состав которого входит миколовая кислота) приходится от 10 до 40% сухой массы вещества микобактерий. Высокое содержание липидов определяет кислото-, спирто- и щелочеустойчивость возбудителя, вирулентность, трудность окрашивания клеток обычными методами и устойчивость в окружающей среде. Липиды экранируют бактериальную клетку, подавляют фагоцитоз, блокируют активность клеточных ферментов, вызывают развитие гранулем и казеозного некроза.

Резистентность. В высохшей мокроте больного клетки сохраняют жизнеспособность и вирулентность в течение 5-6 месяцев. На предметах больного сохраняются более 3 месяцев. В почве сохраняются до 6 месяцев, в воде – до 15 месяцев. Солнечный свет вызывает гибель микобактерий через 1,5 часа, УФЛ – через 2-3 минуты. При пастеризации погибают через 30 минут. Хлорсодержащие

4

препараты вызывают гибель возбудителей туберкулеза в течение 3-5 часов, 5%- ный раствор фенола - через 6 часов.

Факторы патогенности микобактерий:

-корд-фактор – гликолипид клеточной стенки, вызывает повреждение клеточных мембран и ингибирует образование фаголизосомы, обусловливая развитие незавершенного фагоцитоза;

-липиды, содержащие миколовую и фтионовую кислоты, вызывают появление многочисленных гигантских клеток;

Возбудители туберкулеза не образуют экзотоксинов. Высокотоксичными являются продукты распада клеток.

Главным фактором патогенности микобактерий является корд-фактор (название происходит от англ. соrd - жгут, веревка). Корд-фактор обусловливает “скученный тип роста” в жидких средах в виде “извилистых тяжей” (или кос), в которых клетки микобактерий располагаются параллельными цепочками.

Эпидемиология. Туберкулез распространен повсеместно. Основной источник инфекции - больной человек с туберкулезом органов дыхания, выделяющий микробы в окружающую среду с мокротой. Источниками инфекции могут также быть люди с внелегочными формами туберкулеза и больные животные (крупный рогатый скот, верблюды, свиньи, козы и овцы). Основной механизм заражения – аэрогенный. Пути передачи возбудителя - воздушно-капельный и воздушно-пылевой. Входными воротами при этом является слизистая оболочка полости рта, бронхи и легкие. Реже заражение туберкулезом может происходить алиментарным (пищевым) путем при употреблении термически не обработанных мясо-молочных продуктов. Возможен контактно-бытовой путь передачи инфекции от больных туберкулезом при использовании инфицированной одежды, игрушек, книг, посуды и других предметов. Известны случаи заражения людей при уходе за больными животными.

Патогенез. Проникнув в организм человека, микобактерии фагоцитируются.

Вфагоцитах формируются фагосомы, внутри которых микобактерии остаются живыми и размножаются. В фагоцитах микобактерии транспортируются в регионарные лимфатические узлы, сохраняясь длительное время в “дремлющем” состоянии (незавершенный фагоцитоз). При этом происходит воспаление лимфатических путей (лимфангоит) и лимфатических узлов (лимфаденит). В месте внедрения возбудителя формируется очаг воспаления. Это воспаление в течение нескольких недель приобретает специфический характер (развивается реакция гиперчувствительности замедленного типа), в результате чего формируется гранулема. В последующем происходит трансформация макрофагов в эпителиоидные клетки. При слиянии эпителиоидных клеток образуются гигантские многоядерные клетки. Вокруг очага воспаления формируется соединительнотканная капсула, некротизированные ткани обызвествляются. В результате этого происходит формирование первичного туберкулезного комплекса, внутри которого находится казеозная некротизированная ткань и остаются живые микобактерии.

Клиника. Инкубационный период длится от 3-8 недель до 1 года и более.

Клинические проявления туберкулеза многообразны, поскольку микобактерии могут поражать любые органы (кишечник, мочеполовые органы, кожу, суставы). Симптомами туберкулеза являются быстрая утомляемость, слабость, потеря массы

5

тела, длительная субфебрильная температура, обильное ночное потоотделение, кашель с мокротой с кровью, одышкой. Симптомов, характерных только для туберкулеза, нет. При поражении кожи отмечаются изъязвленные очаги. При туберкулезе костей и суставов возникают поражения, характерные для артритов любой этиологии: истончение хрящей, возникновение шипов, сужение полостей суставов.

Иммунитет. Противотуберкулезный иммунитет формируется в ответ на проникновение в организм микобактерий в процессе инфицирования или вакцинации и носит нестерильный характер, что обусловлено длительной персистенцией бактерий в организме. Он проявляется через 4-8 недель после попадания микробов в организм. Формируется как клеточный, так и гуморальный иммунитет.

Клеточный иммунитет проявляется состоянием повышенной чувствительности (сенсибилизации). Благодаря этому организм приобретает способность быстро связывать новую дозу возбудителя и удалять ее из организма: Т-лимфоциты распознают клетки, инфицированные микобактериями, атакуют их и разрушают.

Гуморальный иммунитет проявляется синтезом антител к антигенам микобактерий. Образуются циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), которые способствуют удалению антигенов из организма.

Иммунитет при туберкулезе сохраняется до тех пор, пока в организме есть возбудитель. Такой иммунитет называют нестерильным или инфекционным. После освобождения организма от микобактерий иммунитет быстро исчезает.

Микробиологическая диагностика. Исследуемый материал - мокрота,

аспират бронхов, отделяемое свищей, СМЖ, моча, испражнения. Чаще всего исследуют мокроту. Для диагностики туберкулеза применяют основные и дополнительные методы исследования.

Основные методы:

-бактериоскопический метод (световая и люминесцентная микроскопия);

-бактериологический метод.

Дополнительные методы:

-биологический метод;

-серологический метод;

-кожные аллергические пробы;

-молекулярно-биологический метод (ПЦР).

Бактериоскопическое исследование – это многократное проведение прямой микроскопии мазков из исследуемого материала, окрашенных по ЦилюНильсену. В препаратах можно обнаружить единичные микроорганизмы, если в 1 мл мокроты их содержится не менее 10000-100000 бактериальных клеток (предел метода). Этот метод применяется:

-при обследовании лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 недель, боли в грудной клетке, кровохарканье, потеря массы тела);

-у лиц, контактировавших с больными туберкулезом;

-у лиц, имеющих рентгенологические изменения в легких, подозрительные на туберкулез.

6

При получении отрицательных результатов прибегают к методам обогащения материала: центрифугированию (седиментации) и флотации. Чаще применяют метод флотации.

Метод центрифугирования – исследуемый материал обрабатывают щелочью и центрифугируют. Препарат для микроскопирования готовят из осадка.

Метод флотации – исследуемый материал обрабатывают смесью щелочи и ксилола (бензина, бензола, толуола). Пробу энергично встряхивают 10-15 минут, добавляют дистиллированную воду и выдерживают в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Капельки углевода адсорбируют микобактерии и всплывают, образуя на поверхности пену. Препарат для микроскопирования готовят из образующейся пены.

Бактериологическое исследование проводят путем высева исследуемого материала (после обработки 6-12% раствором серной кислоты) на 2-3 различные по составу питательные среды одновременно. В качестве ускоренных методов бактериологической диагностики, для сокращения времени выделения и идентификации возбудителя до 3-4 дней, применяют метод микрокультур (метод Прайса), а также полностью автоматизированные коммерческие системы бульонного культивирования ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВасТ.

Бактериологический метод позволяет получить чистую культуру для определения ее вирулентности и чувствительности к лекарственным препаратам. Этот метод широко применяется и для контроля за эффективностью проводимой терапии.

Биологическая проба наиболее чувствительна, так как позволяет обнаружить от 1 до 5 микробных клеток в исследуемом материале. Метод используется при исследовании биопсийного материала, а также при получении отрицательных результатов при использовании первых двух методов исследования. Для этого морским свинкам подкожно или внутрибрюшинно вводят исследуемый материал (1 мл). Через 1-2 месяца у животных развивается генерализованный туберкулез с летальным исходом.

Серологический метод. Предложены РСК, РНГА, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, определение ЦИК.

Туберкулинодиагностика основана на определении повышенной чувствительности организма к туберкулину (в результате заражения возбудителями туберкулеза или специфической вакцинации) с помощью кожных аллергических проб. Для постановки кожной аллергической пробы используют туберкулин. Туберкулин - это общее название препаратов, полученных из микобактерии человеческого или бычьего типов:

-старый туберкулин Коха - АТК (Alt Tuberculin Косh), впервые получен в 1880 г. Р. Кохом. Представляет собой фильтрат автоклавированной 5-6-недельной бульонной культуры микобактерий туберкулеза;

-сухой очищенный туберкулин - РРD (Purified Protein Derivative),

полученный из культур M. tuberculosis и M. bovis;

-очищенный туберкулин, приготовленный М.А. Линниковой (РРD-L) из культур M. tuberculosis и M. bovis.

Для диагностики туберкулеза первоначально использовали накожную пробу Пирке (скарификационную). В настоящее время с целью своевременного выявления

7

первичного инфицирования детей и подростков применяется внутрикожная проба Манту. При постановке пробы Манту туберкулин (РРD) вводят строго внутрикожно на внутреннюю поверхность средней трети предплечья до образования “пуговки”. Результаты пробы учитывают через 48-72 часа по наличию папулы. Проба Манту оценивается следующим образом:

-отрицательная - наличие реакции от укола до 2 мм в диаметре;

-сомнительная - папула диаметром 2-4 мм или гиперемия;

-положительная - папула диаметром 5-17 мм у детей и подростков и 5-21 мм

увзрослых;

-гиперергическая - папула диаметром более 17 мм у детей и подростков и более 21 мм у взрослых.

Туберкулиновая реакция становится положительной через 4-6 недель после инфицирования или вакцинации. После вакцинации положительные реакции на туберкулин сохраняются в течение 3-7 лет. Положительный результат нельзя рассматривать как признак активного процесса. Положительная проба Манту указывает, что человек ранее был инфицирован микобактериями. Люди с положительными туберкулиновыми пробами подвержены риску заболевания в результате активации первичного очага. Если у взрослых положительная реакция свидетельствует об инфицировании, то у детей, ранее не реагировавших на туберкулин, появление впервые зарегистрированной положительной реакции (вираж туберкулиновой пробы) указывает на недавнее заражение и служит показанием для проведения клинического обследования и лечения.

При отрицательной реакции риск активизации первичного очага отсутствует, но существует опасность первичного инфицирования. Отрицательная проба отмечается у здоровых неинфицированных лиц, а также у больных промежуточными формами туберкулеза.

Для экспресс-диагностики туберкулеза применяют РИФ с использованием видоспецифических моноклональных антител, метод лазерной флюоресценции, микробиочипы, а также ПЦР, позволяющую сократить исследования до 2 суток.

Лечение. Антибиотикотерапия - основной метод лечения туберкулеза. По степени эффективности противотуберкулезные препараты делятся на 3 группы:

-группа А - наиболее эффективные препараты: изониазид (антиметаболит, аналог изоникотиновой кислоты, ингибирует синтез ферментов, участвующих в синтезе миколовых кислот, которые входят в состав клеточной стенки микобактерий), рифампицин и их производные. Получены препараты, превосходящие рифампицин по лечебным свойствам (рифапентин и рифабутин), а также комбинированные препараты (рифатер, рифанг и т. д.);

-группа В - препараты средней эффективности: этамбутол (синтетический препарат, ингибирует ферменты, участвующие в синтезе клеточной стенки микобактерий, активен только в отношении размножающихся бактерий), канамицин, стрептомицин, циклосерин, этионамид (протионамид), пиразинамид, флоримицин, производные фторхинолонов;

-группа С - малые противотуберкулезные препараты (ПАСК и тибон или тиоцетозон). Эта группа препаратов в экономически развитых странах и в России не применяется.

8

Очень быстро появляются штаммы микобактерий, резистентные к противотуберкулезным препаратам. Поэтому используют комбинации препаратов с разным механизмом действия, а также производят частую замену препаратов. Это замедляет появление устойчивых форм. В современных схемах лечения применяют одновременно по 3-5 препаратов (трех-пятикомпонентные схемы лечения).

Специфическая профилактика. Специфическую профилактику осуществляют путем введения живой вакцины БЦЖ (ВСG - Bacille Calmette-Guerin). Штамм БЦЖ селекционирован в 1919 г. А. Кальметтом и К. Гереном путем длительного пассирования M. bovis на картофельно-глицериновой среде с добавлением желчи.

Вакцинацию проводят у новорожденных на 3-7-й день жизни внутрикожно. На месте введения вакцины формируется инфильтрат с небольшим узелком в центре. Обратное развитие инфильтрата происходит в течение 3-5 месяцев. Ревакцинация – в 7 и 14 лет лицам с отрицательной реакцией Манту, поэтому перед ее проведением ставится проба Манту. У новорожденных со сниженной резистентностью и в регионах, благополучных по туберкулезу, применяется менее реактогенная вакцина БЦЖ-М, содержащая в 2 раза меньшее количество микробов.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

Самостоятельная работа:

1.Студенты готовят препараты из культур непатогенных микобактерий, окрашивают их по Цилю-Нильсену, микроскопируют, зарисовывают микроскопическую картину в рабочую тетрадь.

2.В рабочей тетради студенты зарисовывают схему лабораторной диагностики туберкулеза.

7.Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки темы:

8.1.Основная:

1.Галынкин В., Заикина Н., Кочеровец В. Основы фармацевтической микробиологии. 2008.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

3.Микробиология: учеб. для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальности 060301.65 “Фармация” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 608 с.: ил.

4.Одегова Т.Ф., Олешко Г.И., Новикова В.В. Микробиология. Учебник для фармацевтических вузов и факультетов. - Пермь, 2009. - 378 с.

8.2.Дополнительная:

9

1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.