V.4.1. Приготовление стандартных растворов и построение калибровочных кривых

Стандартный раствор ТФФ. 25 мг ТФФ взвешивают на аналитических весах, растворяют в 100 мл ацетона при нагревании до 30 °С на водяной бане. Концентрация полученного основного раствора 0,25 мг/мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

Стандартные рабочие растворы ТФФ готовят из основного раствора, разводя его в 2, 5, 10, 20, 50 и 100 раз ацетоном. Для этого в градуированные пробирки помещают 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1 мл основного раствора ТТФ и доливают до 10 мл ацетоном. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин. Каждая концентрация готовится в трех-четырех повторностях. В течение 1 ч после приготовления рабочие растворы должны быть проанализированы, при этом не следует допускать попадания на них прямых солнечных лучей. Интенсивность окраски рабочих растворов ТФФ, содержащих от 0,0025 до 0,1250 мг/мл вещества, измеряют на ФЭК с синим светофильтром, используя кювету толщиной 1 мм.

Результаты измерения оптической плотности рабочих растворов приведены в табл. V.4.2. Калибровочная кривая, построенная по этим данным, представлена на рис. V.4.1. Линейная зависимость оптической плотности от концентрации сохраняется в интервале от 0,0025 до 0,1250 мг/мл.

Таблица V.4.2

Результаты измерения оптической плотности (Х±S) рабочих растворов ТФФ

Толщина кюветы, мм	Концентрация ТФФ, мг/мл	Средняя оптическая плотность D
1	0,0025	0,0088±0,0015
	0,0050	0,0163±0,0026
	0,0125	0,0330±0,0053
	0,0250	0,0620±0,0014
	0,0500	0,1213±0,0092
	0,1250	0,3045±0,0098

Значение средней оптической плотности определяли по формуле

а значение S (оценка среднего квадратичного отклонения) - по формуле

Оценки получены при n=4.

0266A10296f20727

Рис. V.4.1. Калибровочный график для определения концентрации формазана

V.4.2. Приготовление рабочих растворов

0,5 %-ный раствор 2,3,5-ТТХ. 0,5 г 2,3,5-ТТХ растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор готовят перед употреблением.

Основной раствор ТФФ. 25 мг ТТФ растворяют в 100 мл ацетона при нагревании до 30°С на водяной бане.

V.4.3. Реактивы

Ацетон ч.д.а., ГОСТ 2606-63.

Трифенил - третразолийхлористый (2,3,5 - ТТХ) ч.д.а. ТУ 6-09-5328-68.

Трифенилформазан (формазан: 2,3,5 - ТФФ) получают следующим образом. 2,3,5 - ТТХ растворяют в 5 мл дистиллированной воды. 1,26 г гидросульфита натрия (NaHSO₃) растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Растворы сливают, после выпадения темно-красного осадка смесь фильтруют через стеклянный пористый фильтр и осадок промывают на фильтре дистиллированной водой до отсутствия реакции на хлориды (с 0,5%-ным раствором AgNО₃). Осадок (2,3,5 - трифенилформазан) высушивают в сушильном шкафу.

Гидросульфит натрия ч.д.а. ТУ МХПГХП 126-56.

Азотнокислое серебро ч.д.а. ГОСТ 1277-63.

V.5. Определение активности фосфатазы (аф) [5]

Навеску почвы (1 г воздушно-сухой почвы, а влажной - с учетом влажности) помещают в пробирку и заливают 2 мл 1%-ного раствора фенолфталеинфосфата натрия, рН которого доводят до 7,0. Пробирки закрывают резиновыми пробками, тщательно взбалтывают и помещают в термостат на 3 ч при 30 °С. После инкубации для извлечения продукта гидролиза органического субстрата (фенолфталеина) и получения бесцветных и прозрачных почвенных вытяжек в каждую пробирку добавляют 5 мл 0,1 М СаСl₂или 0,1 % К₂SO₄, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

К 5 мл центрифугата приливают 5 мл 10%-ного раствора аммиака. Окрашенный в розовый цвет раствор колориметрируют на ФЭК с синим светофильтром, используя кювету толщиной 20 мм. Окраска устойчива в течение 1 ч. Активность фосфатазы выражают в мг фенолфталеина на 1 г воздушно-сухой почвы за 1 ч (мг/г ч). Количество фенолфталеина, отщепленного от фенолфталеинфосфата натрия под действием фосфатазы, находят по калибровочной кривой.

Расчет активности фосфатазы ведется по формуле

 (V.5.1)

где С - концентрация фенолфталеина, найденная по калибровочной кривой; V₁- количество раствора для приготовления почвенной вытяжки (7 мл); V₂ - аликвота (5 мл); а - навеска почвы (1 г); Т - время инкубации (3 ч).

На основании закона Бера С можно выразить как

 (V.5.2)

где С - концентрация поглощающего вещества; D - показания ФЭК, характеризующие поглощение света; К₁ - коэффициент пропорциональности.

Подставляя это выражение в формулу для определения активности фосфатазы, получают

 (V.5.3)

При использовании кюветы толщиной 20 мм

_{0266A10296F20727}

 (V.5.3а)

Результаты фотоэлектроколориметрирования и вычисления АФ записывают по образцу, представленному в табл. V.5.1.

Таблица V.5.1

Пример записи результатов вычисления АФ

Дата	Вариант	Толщина кюветы, мм	Показания ФЭК (D)	АФ	Средняя АФ	Примечание
1 марта 1983 г.	1	20	0,115	0,10
			0,109	0,10
			0,120	0,11	0,10
			0,118	0,10
	2		0,200	0,18	0,18
			0,205	0,18
			0,200	0,18
			0,195	0,17