стандарты лечения / Laboratornyi-Spravochnik-2012__Synevo
.pdf
Расчет коэффициента соотношения концентрации ДНК Gardnerella vagi" nalis и ДНК Lactobacillus spp. проводится по формуле:
КC Lsp Gv = lg[K ДНК Lsp/ml] – lg[К ДНК Gv/ml], где
K ДНК Lsp/ml – количество копий ДНК Lactobacillus spp. в 1 мл клинического материала.
К ДНК Gv/ml – количество копий ДНК Gardnerella vaginalis в 1 мл клинического материала
КС < 1,0 – высокая вероятность БВ. КС > 2,0 – низкая вероятность БВ.
КАНДИДОЗ
КОД 3022. ПЦР. Candida albicans (урогенитальный соскоб, качественное определение)
Кандидоз – инфекционное поражение нижнего отдела мочеполовой системы, вызываемое дрожжеподобными грибами рода Candida. Диагноз урогенитального кандидоза ставится на основании совокупности клинических и лабораторных данных. При этом обнаружение грибов Candida лабораторными методами при отсутствии симптомов не является показанием для лечения, т.к. приблизительно у 10%220% здоровых женщин во влагалище выявляются Candida albicans и другие дрожжеподобные грибы. Критериями постановки диагноза вульвовагинального кандидоза, согласно Европейским рекомендациям 2011 г. по ведению пациенток с синдромом патологических выделений из влагалища (2011 European (IUSTI/WHO) Guideline on the Management of Vaginal Discharge) (уровень доказательности III, класс В), является:
1.Отсутствие специфического «рыбного» запаха (в аминном тесте) является вспомогательным, а не диагностическим критерием.
2.Дрожжевые клетки или псевдогифы в нативном мазке отделяемого влагалища (чувствительность – 40260%).
3.Дрожжевые клетки или псевдогифы в мазке, окрашенном по Граму (чувствительность – до 65%).
4.Выделение чистой культуры Candida. Предпочтительно, чтобы культура была охарактеризована как albicans или non2albicans. Если посев осуществлен на среду Сабуро, желательно также описать рост культуры как слабый, средний или массивный.
5.Повторное выделение культуры одного и того же non2albicans вида (обычно C.glabrata) может указывать на формирование резистентности микроорганизма к антигрибковым препаратам.
Микроскопическое исследование (преобладание вегетирующих форм – мицелий и почкующиеся дрожжевые клетки). Проводится исследование нативного материала с использованием специальных растворов. Этот метод не позволяет достаточно точно выявлять возбудителя в связи с субъективностью оценки результата, что осложняется тем, что некоторые не2альбиканс виды не формируют псевдогифы или гифы и не распознаются при световой микроскопии. Таким образом, аналитическая чувствительность метода для выявления грибов рода Candida составляет 35245%.
ПЦР – метод прямого определения возбудителя в забранном материале с диагностической чувствительностью и специфичностью составляет 90% и 98% соответственно. Важным аспектом является возможность видовой
591
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
дифференцировки грибов рода Candida, т.е. обнаружение не2albicans видов, что имеет значение для определения тактики лечения.
Материал: урогенитальный соскоб. Пробирка: эппендорф с транспортной средой. Метод: ПЦР качественный анализ.
Принцип метода: Выделение ДНК Candida albicans из клинического материала; проведение реакции амплификации с детекцией продуктов ПЦР «по конечной точке».
Анализатор: амплификатор «Терцик» (ДНК2технология, Россия), детектор флуоресценции «Джин» (ДНК2технология, Россия).
Тест системы: ДНК2Технология (Россия).
Аналитические характирестики: Чувствительность: 2000 копий/мл. Специфичность: 98%.
Основные показания к назначению анализа: выявление ДНК Candida albicans в клиническом материале.
Референтные значения лаборатории СИНЭВО Украина:
«Не обнаружена»/«Обнаружена».
КОД 3034. ПЦР. Candida (albicans + krusei + glabrata,
урогенитальный соскоб, качественное определение, Real time)
В последние годы увеличивается число больных кандидозом, который регистрируется не только как самостоятельное заболевание, но и как сопутствующее другим инфекциям, передаваемым половым путем. Часто кандидоз диагностируется в сочетании с бактериальным вагинозом. C. albi" cans, безусловно, имеет наибольшее значение в возникновении данного заболевания и является возбудителем кандидоза в 75280% случаев. Однако в последние годы немаловажное значение приобретают не2albicans виды, среди которых наибольшее значение имеют C. glabrata, C. tropicalis, C. para" psilosis, C. krusei и др. Следует отметить, что не2albicans виды ассоциируются с хроническим течением вульвовагинального кандидоза и трудно поддаются терапии. Значительная доля изолятов C.glabrata и почти все изоляты C.krusei устойчивы к местным и системным препаратам имидазолового ряда. Выявление этих видов Candida, скорее всего, потребует коррекции терапии. Показано, что C.glabrata чаще выделяется при ВВК на фоне сахарного диабета и ВИЧ2инфекции. Поэтому ПЦР2тест2 системы, выявляющие только C. albicans, обладают высокой специфичностью, но низкой чувствительностью, т.к. пропускают non"albi" cans виды. В то же время, ПЦР2тест2системы для выявления Candida spp. обладают высокой чувствительностью, но низкой специфичностью, т.к. выявляют виды, не имеющие диагностического значения, что может привести к получению ложноположительных результатов. Учитывая это, возникает необходимость в выявлении и дифференцировке диагностически значимых видов Candida.
Материал: урогенитальный соскоб. Пробирка: эппендорф с транспортной средой.
Метод: ПЦР в режиме Real2time качественный анализ.
Принцип метода. Выявление Candida albicans, Candida glabrata и Candida krusei методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
592
гибридизационно2флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа: экстракцию (выделение) ДНК из образцов клинического материала, амплификацию фрагмента ДНК данного микроорганизма и гибридизационно2флуоресцентную детекцию, которая производится непосредственно в ходе ПЦР («Real time»). Экстракция ДНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО2FL), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами ДНК проводится реакция одновременной амплификации фрагментов ДНК Candida albicans, Candida glabrata и Candida krusei при помощи специфичных к каждому из них праймеров и фермента Taq2полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно2меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизируются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК2 мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. К олигонуклеотидным зондам, специфичным к различным ДНК2мишеням, прикреплены различные флуоресцентные метки. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации каждой ДНК2мишени путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по соответствующему каналу. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
Анализатор: детектирующий амплификатор в режиме «реального времени» «Rotor2Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия).
Тест системы: АмплиСенс (Россия).
Аналитические характеристики:
Чувствительность C.albicans = 1000 копий/мл. Чувствительность C.glabrata = 1000 копий/мл. Чувствительность C.krusei = 1000 копий/мл.
Основные показания к назначению анализа: одновременное выявление ДНК Candida albicans, Candida glabrata и Candida krusei методом ПЦР с гибридизационно2флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени».
Референтные значения лаборатории СИНЭВО Украина: в
лаборатории СИНЭВО результаты выдаются по каждому виду отдельно!!!
«Не обнаружена»/«Обнаружена».
ТРИХОМОНИАЗ
КОД 3023. ПЦР. Trichomonas vaginalis (урогенитальный соскоб, качественное определение)
Урогенитальный трихомониаз – инфекционное заболевание, вызываемое Trichomonas vaginalis, относящееся к группе ИППП. У женщин средой обитания T.vaginalis является слизистая оболочка влагалища, у мужчин – предстательная железа и семенные пузырьки. Мочеиспускательный канал может поражаться у обоих полов. У большинства мужчин трихомониаз протекает бессимптомно. Лечению подлежат больные как с наличием воспалительных явлений, так и при отсутствии таковых. Обязательное лечение носителей диктуется тем, что они могут быть источниками заражения.
593
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
Клиническое значение
У женщин: вагинит, уретрит, цервицит.
Кроме того, трихомониаз связывают с развитием таких опасных осложнений как рак шейки матки, ВЗОМТ, бесплодие.
У мужчин: уретрит (составляет около 11% случаев негонококковых уретритов).
Присутствие трихомонад в сперме может вызывать изменение подвижности и жизнеспособности сперматозоидов, приводя к бесплодию. Бессимптомное носительство трихомониаза, способствующее развитию осложнений в связи с отсутствием терапии, характерно для 10250% женщин и 60270% мужчин. Кроме того, T. vaginalis может передаваться интранатально. T. vaginalis может приводить к развитию таких осложнений как преждевременный разрыв плодных оболочек, преждевременные роды, низкий вес ребенка при рождении.
Клинические особенности смешанных инфекций:
•T. vaginalis + HSV – выраженность клинической симптоматики, большая частота манифестных форм;
•T. vaginalis + N.gonorrhoeae – посттрихомонадные осложнения,
повышенная устойчивость гонококков к антибиотикам. Лабораторными критериями постановки диагноза трихомониаза
являются:
•выделение чистой культуры Тrісhоmоnаs vаgіnаlіs в клинических образцах, или
•обнаружение Тrісhоmоnаs vаgіnаlіs в нативном препарате, или
•обнаружение Тrісhоmоnаs vаgіnаlіs цитологическим методом (при окраске по Романовскому2Гимзе, метиленовым синим, акридиновым оранжевым), или
•обнаружение Тrісhоmоnаs vаgіnаlіs в клинических образцах путем определения антигена (методом реакции непрямой иммунофлюоресценции), или
•обнаружение нуклеиновой кислоты возбудителя (методом
полимеразной цепной реакции).
Диагностика на основании клинических проявлений. К классическим признакам трихомонадного вагинита относят: пенистые выделения, «клубничную шейку матки» вследствие диффузно2точечных кровоизлияний, а также pH во влагалище более 4,5. Интересен тот факт, что пенистые выделения обнаруживают лишь у 10% пациенток с трихомониазом, «клубничную шейку» – в 2% случаев, а подъем pH – у 16%. Таким образом, с учетом частоты бессимптомного течения трихомониаза, диагноз исключительно на основании клинической картины не будет поставлен у 88% пациенток, а у 29% может быть установлен ложноположительный диагноз.
Микроскопия. Микроскопическое исследование включает две методики. Первая – это выявление трихомонад в нативном препарате при фазовом контрастировании. Обнаружение типичных овальных или грушевидных тел чуть больше лейкоцита, имеющих жгутики и совершающих характерные толчкообразные поступательные движения, позволяет подтвердить диагноз трихомониаза. При назначении этого исследования не стоит забывать о том, что чувствительность метода варьирует в пределах 35280%, интерпретация результатов основана на субъективной оценке, а потому характеристики метода в значительной мере зависят от опыта персонала и времени,
594
прошедшем с момента забора материала. Так, показано, что уже через 2 часа 78% трихомонад теряют подвижность, и, соответственно, постановка диагноза с помощью исследования мазка нативного препарата становится практически невозможной. Вторая методика – это окрашивание препарата метиленовым синим или по Граму. Трихомонады имеют типичную форму с правильно очерченным ассиметричным ядром на фоне нежно2ячеистой структуры цитоплазмы. Для выявления жгутиков и ундулирующей мембраны препарат следует окрашивать по Романовскому2Гимзе. При исследовании окрашенного препарата велика вероятность получения ложноположительных результатов (эпителиальные клетки могут быть приняты за трихомонады). Так, внедрение ПЦР в лабораторную практику привело к расхождениям в результатах, которые клиницисты часто трактовали в пользу микроскопии. При этом в образцах при микроскопии обнаруживались клеточные элементы разной формы (преимущественно округлые), которые трудно было отнести к эпителиальным клеткам, незрелым клеткам спермиогенеза или лейкоцитам. Такие клеточные элементы часто трактуются как так называемые «атипичные формы» трихомонад. Однако показана объективно более высокая аналитическая чувствительность методов амплификации нуклеиновых кислот перед методами микроскопии, и субъективность микроскопического анализа.
Культуральный метод («золотой стандарт» для диагностики трихомониаза) – выращивание трихомонад в бульонной культуре или с использованием высокочувствительных коммерческих сред. Однако микробиологический посев занимает около 7 дней, в течение которых инфекция в организме пациента прогрессирует, а сам пациент может продолжать распространение инфекции. Кроме того, для получения роста в культуре требуется содержание не менее чем 3002500 трихомонад/мл в пробе биоматериала. Диагностическая чувствительность метода составляет 88292%, а диагностическая специфичность приближается к 100%. Метод не получил широкого применения в клинической практике в качестве прямого диагностического метода. В связи с тем, что получение результатов посева отсрочено во времени, а микроскопия не обладает достаточной диагностической чувствительностью, рекомендуется использовать эти методы совместно для диагностики трихомониаза, однако показано, что даже при сочетании клинических данных, микроскопических и культуральных методов исследования, около 15% пациентов не получают должного лечения вследствие отсутствия установленного диагноза. ПЦР позволяет достичь диагностической чувствительности в более чем 95% при специфичности 98%. ПЦР может и должен использоваться в случаях, когда проведение микробиологического посева затруднено, требуется длительная транспортировка образцов, а также в спорных случаях, когда результаты микроскопического и бактериологического исследований расходятся.
Материал: урогенитальный соскоб. Пробирка: эппендорф с транспортной средой. Метод: ПЦР качественный анализ.
Принцип метода: Выделение ДНК Trichomonas vaginalis из клинического материала; проведение реакции амплификации с детекцией продуктов ПЦР «по конечной точке».
Анализатор: амплификатор «Терцик» (ДНК2Технология, Россия), детектор флуоресценции «Джин» (ДНК2технология, Россия).
595
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
Тест системы: ДНК2технология (Россия).
Аналитические характеристики: Чувствительность: 2000 копий/мл. Специфичность: 96%.
Основные показания к назначению анализа: выявление ДНК
Trichomonas vaginalis в клиническом материале.
Референтные значения лаборатории СИНЭВО Украина:
«Не обнаружена»/«Обнаружена».
ГОНОРЕЯ
КОД 3024. ПЦР. Neisseria gonorrhoeae (урогенитальный соскоб, качественное определение)
Гонококковая инфекция (гонорея) – инфекция, передаваемая половым путем, поражающая преимущественно мочеполовую систему человека, вызываемая Neisseria gonorrhoeae. Заболеваемость гонококковой инфекцией подростков отличается от общей заболеваемости в популяции незначительно, что особенно важно, учитывая возможность бессимптомного течения заболевания (10% мужчин и 50290% женщин), и, как следствие, развитие осложнений со стороны репродуктивной системы.
Клиническое значение
У мужчин основным проявлением гонококковой инфекции является уретрит, который может приводить к развитию следующих осложнений:
•Простатит.
•Везикулит.
•Эпидидимит.
•Парауретрит.
•Периуретрит и др.
Вслучае хронизации и затяжного течения могут возникать половые расстройства, бесплодие.
У женщин, в зависимости от локализации воспалительного процесса, различают:
•Гонококковую инфекцию нижних отделов мочеполовой системы (цервицит, уретрит, цистит, вульвовагинит).
•Воспалительные заболевания органов малого таза (эндометрит, сальпингит, оофорит, пельвиоперитонит).
Вслучае хронизации и затяжного течения может возникать внематочная беременность, бесплодие.
Другие локализации поражения (как у мужчин, так и у женщин):
•Аноректальная область.
•Ротоглотка.
•Стриктуры глаза (гонококковая офтальмия новорожденных). Гонококковый конъюнктивит (гонобленнорея), как правило, возникает у новорожденных в первые часы2дни жизни. Инфицирование происходит при прохождении плода через зараженные родовые пути матери или (в редких случаях) инфицированными руками обслуживающего персонала родильных домов. Характерным является обильное слизисто2гнойное отделяемое в виде «мясных помоев», которое буквально струей исторгается из конъюнктивального мешка при раскрытии сомкнутой отечными веками глазной щели.
596
Убеременных гонококковая инфекция приводит к:
•Преждевременному разрыву плодных оболочек.
•Преждевременным родам.
•Инфицированию плода.
Лабораторными критериями постановки диагноза гонореи являются:
1.Выделение чистой культуры типичных грамотрицательных оксидазопозитивных (или каталазопозитивных) диплококков (напр.,
Neisseria gonorrhoeae) в клинических образцах, или
2.Выявление Neisseria gonorrhoeae в клинических образцах путем определения антигена (методом ИФА или непрямой иммунофлуоресценции – РНИФ) или обнаружение нуклеиновой кислоты возбудителя (методом полимеразной цепной реакции). В случае определения антигена или нуклеиновой кислоты гонококка у детей инфекция может быть зарегистрирована только при наличии культуральной диагностики с определением каталазного теста, или
3.Обнаружение грамотрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры у мужчин.
При подозрении на гонококковую инфекцию необходимо проведение микроскопии с окраской по Граму. Этот тест позволяет установить диагноз в большинстве случаев, когда имеются явные клинические проявления. Гонококк при этом выглядит как внутриклеточный грамотрицательный диплококк. Однако такая картина встречается далеко не во всех случаях инфицирования N. gonorrhoeae. Например, у женщин часто отсутствует классическая картина с фагоцитированными гонококками (диагностическая чувствительность метода для женских образцов – 36,2%), а исследование фарингеальных, конъюнктивальных и ректальных проб этим методом неинформативно. Не стоит забывать, что в материале могут присутствовать и другие виды нейссерий, которые фенотипически неотличимы от N. gonor" rhoeae.
Культуральная диагностика. Проведение посева обязательно при необходимости судебно2медицинской экспертизы, неэффективности лечения (позволяет определить чувствительность возбудителя к антимикробным препаратам), обследовании воспалительных заболеваний органов малого таза. Основными недостатками культурального метода являются длительность проведения исследования и необходимость наличия живых гонококков в забранном материале.
В настоящее время все большее распространение для диагностики гонококковой инфекции получают методы амплификации нуклеиновых кислот – полимеразная цепная реакция (ПЦР). Важно помнить, что и выделение культуры возбудителя, и ПЦР должны проводиться во всех случаях взятия проб, а не только при обнаружении гонококка при микроскопии. По данным зарубежных авторов, у пациентов с бессимптомной инфекцией МАНК являются более чувствительным методом, чем получение культуры. Так, Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) включили методы амплификации нуклеиновых кислот в перечень доступных методов для диагностики гонореи (Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines, 2010).
Материал: урогенитальный соскоб. Пробирка: эппендорф с транспортной средой. Метод: ПЦР качественный анализ.
Принцип метода: Выделение ДНК Neisseria gonorrhoeae из клинического
597
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
материала; проведение реакции амплификации с детекцией продуктов ПЦР «по конечной точке».
Анализатор: амплификатор «Терцик» (ДНК2технология, Россия), детектор флуоресценции «Джин» (ДНК2технология, Россия).
Тест системы: ДНК2технология, Россия.
Аналитические характеристики: Чувствительность: 2000 копий/мл. Специфичность: 99%.
Основные показания к назначению анализа: выявление ДНК Neisseria gonorrhoeae в клиническом материале.
Референтные значения лаборатории СИНЭВО Украина:
«Не обнаружена»/«Обнаружена».
Результаты количественных измерений вирусной или бактериальной нагрузки выражаются в различных величинах, которые иногда сложно сопоставить и интерпретировать.
ОЦЕНКА БИОЦЕНОЗА
КОД 3042. ПЦР. Фемофлор 16 КОД 3043. ПЦР. Фемофлор 8 КОД 3075. ПЦР. Фемофлор Скрин
В настоящее время регистрируется тенденция к снижению заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП), за исключением вирусных ИППП, что может быть связано, с одной стороны, с совершенствованием диагностических мероприятий и расширением возможностей лабораторного обследования больших групп населения доступными и информативными методами исследования, а с другой стороны, вероятно, регистрируемый уровень заболеваемости не отражает истинного состояния проблемы (отсутствие качественных реагентов, тест2 систем, недостаточная оснащенность современным лабораторным оборудованием, коммерциализация, самолечение и др.). В цепи данных рассуждений нельзя упускать из вида следующее – этиологический диагноз ИППП устанавливается только на основании результатов лабораторных исследований, регламентированных нормативными документами МЗ, соответственно, показатели заболеваемости в значительной степени определяются качеством лабораторных исследований на всех этапах его проведения, и существует определенная вероятность диагностических ошибок (каждый метод a priori имеет допустимый процент ошибки), обусловленная как объективными причинами, так и субъективными, в том числе профессиональной квалификацией врача клинической лабораторной диагностики. Как известно, наиболее важными факторами, влияющими на распространение ИППП, являются социально2демографические, биологические, поведенческие и др. (Прохоренков В.И. и др., 1998; McCuster S. еt al., 1988; Hessol N.A. et al., 1996). В соответствии с Международной классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем (102я редакция), уреаплазмоз, микоплазмоз (за исключением Mycoplasma genital" ium), бактериальный вагиноз, урогенитальный кандидоз выведены из числа инфекций, передаваемых половым путем. В связи с этим урогенитальные заболевания, ассоциированные с данными микроорганизмами, исключены Министерством здравоохранения из ежегодного статистического отчета с
598
1999 года, поэтому официальных показателей заболеваемости по этим нозологиям с 1999 года нет. Проводимый до 1999 года учет больных за пятилетний период с 1993 года по 1998 год продемонстрировал увеличение заболеваемости уреаплазмозом в 3,9 раза, бактериальным вагинозом – в 4,8 раз, урогенитальным кандидозом – в 3,2 раза. Удельный вес уреаплазмоза в структуре ИППП составил к 1998 году 7,0%, урогенитального кандидоза – 17,8%, удельный вес бактериального вагиноза увеличился в 3 раза. Дисбаланс микробиоты урогенитального тракта женщин, обусловленный условно2патогенными микроорганизмами представляет собой симптомокомплекс, характеризующийся изменением качественного и/или количественного состава нормобиоты, метаболическими и иммунными нарушениями, в ряде случаев – клиническими проявлениями. Соответственно, частным проявлением выраженного дисбаланса биоты является бактериальный вагиноз. Этиологическая структура урогенитальных инфекций, обусловленных условно2патогенной биотой, представлена ассоциацией нескольких микроорганизмов. В свою очередь, стертая малосимптомная субъективная и/или объективная клиническая симптоматика, отсутствие специфических патогномоничных симптомов практически в большинстве случаев приводит к поздней обращаемости женщин в лечебные учреждения, уже на стадии развития осложнений и нарушения репродуктивной функции. Поздняя обращаемость на стадии развития осложнений со стороны репродуктивной функции позволяет рассматривать данную проблему как актуальную, имеющую медико2социальное значение.
В этой связи в качестве скринингового метода диагностики состава биоты урогенитального тракта женщин сотрудниками курса «Лабораторной диагностики и лабораторной микологии» при кафедре дерматовенерологии и клинической микологии ГОУ ДПО РМАПО и коллегами НПФ «ДНК2 Технология» (Москва) сделана попытка создания эффективного способа клинико2лабораторной диагностики дисбаланса биоты, позволяющего расширить диагностические возможности выявления дисбиотических нарушений на ранней стадии до развития осложнений. В основу способа положена впервые предлагаемая авторами комплексная количественная оценка биоты методом ПЦР в реальном времени (РВ) с проведением сравнительного анализа конкретных представителей нормо2 и условно2 патогенной биоты с общим количеством микроорганизмов с целью выявления дисбаланса биоты, степени его выраженности и определения этиологической роли конкретных микроорганизмов в его развитии при условии контроля качества получения клинического образца для исследования.
599
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
600