стандарты лечения / Laboratornyi-Spravochnik-2012__Synevo
.pdf
МОЛЕКУЛЯРНО БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ
КОД 3001. Вирус гепатита В (качественное определение) КОД 3002. Вирус гепатита В (количественное определе
ние в режиме Real time)
Выявление ДНК вируса гепатита В (Hepatitis B virus) методом полимераз2 ной цепной реакции (ПЦР) в плазме крови. Определяемый фрагмент – уни2 кальная последовательность ДНК гена структурного белка вируса гепатита В. Специфичность определения – 97,6% и диагностическая чувствитель2 ность соответственно 98%. Аналитическая чувствительность – 200 вирус2 ных частиц (копий) в 1 мл, прошедшей выделение ДНК пробе. Количествен2 ная характеристика содержания ДНК HВV в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии. По данным литерату2 ры, если концентрация вируса меньше 2х105 копий/мл, то прогноз курса ле2 чения благоприятный, если выше, то, возможно, необходимо пересмотреть схемы лечения. Снижение концентрации ДНК вируса гепатита В в течение недели после начала курса лечения не менее чем на треть является быст2 рым и точным параметром для предсказания эффективности терапии, при2 водящей к раннему вирусологическому ответу.
Основные показания для назначения анализа:
1.Обнаружение ДНК ВГВ в случае хронического гепатита с отрицатель2 ными иммунологическими маркерами.
2.Мониторинг вирусемии.
3.Мониторинг проводимой противовирусной терапии.
Материал: венозная кровь.
Условия обработки и стабильность пробы: вакутайнер, содержащий ЭДТА.
Метод: Real2Time PCR.
Референтные значения в лаборатории «СИНЭВО Украина»:
1.ДНК ВГВ «не обнаружен».
2.Линейный предел составляет 250 МЕ/мл.
Коэффициент пересчета:
ВГВ2ДНК (МЕ/мл) x 3 = ВГВ2ДНК (копий/мл).
Интерпретация результатов:
1.Результат «не обнаружен» свидетельствует, что речь об очень низкой
вирусемии (ниже линейного предела) или об отсутствии вирусемии.
2. Уровень вирусемии может коррелировать с иммунологическими марке2 рами, биохимическими для определения фазы хронической инфекции ВГВ:
Фаза инфекции |
Статус HBeAg |
Уровень ДНК ВГВ Уровень АЛТ |
|
Фаза иммунной |
HBeAg(+) |
Повышенный |
В норме |
толерантности |
|
|
|
Фаза иммунной |
HBeAg(+) |
Повышенный |
Повышенный |
активности |
anti2HBe (+) |
|
|
(хронический |
|
|
|
гепатит) |
|
|
|
Нерепликативная |
HBeAg (2) |
Повышенный |
В норме |
фаза (неактивный anti2HBe (+)
носитель HBsAg)
483
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
Интерферирующие факторы: данный вид исследований действителен только для плазмы, отобранной с антикоагулянтом ЭДТА. Анализ других ви2 дов проб может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам. Содержание гепарина в крови может ингибировать протека2 ние метода ПЦР.
КОД 3003. Вирус гепатита С (качественное определение) КОД 3004. Вирус гепатита С (генотипирование Real time) КОД 3005. Вирус гепатита С (количественное определение)
Вирус гепатита С (ВГС) принадлежит к семейству Flaviviridae и передает2 ся преимущественно парентеральным путем, причем процент случаев ин2 фицирования ВГС выше среди пациентов, перенесших трансплантацию ор2 ганов, гемотрансфузию, получающих множественные внутривенные инъек2 ции (наркоманы) а также у находящихся на почечном диализе. Острые ин2 фекции, как правило, протекают легко или бессимптомно, но прогрессиро2 вание в сторону развития хронического гепатита регистрируется в 60290% случаев. Выявление РНК вируса гепатита С (Hepatitis С virus) методом поли2 меразной цепной реакции (ПЦР) в сыворотке крови. Определяемый фраг2 мент – консервативный участок генома вируса гепатита С. Специфичность определения – 96,2%. Диагностическая чувствительность определения – 99,3%, аналитическая чувствительность – 200 копий в 1 мл обработанного образца. Согласно рекомендациям ВОЗ, установление диагноза гепатита С возможно на основании троекратного обнаружения РНК ВГС в сыворотке крови больного при отсутствии других маркеров гепатита. РНК вируса гепа2 тита С выявляется в крови уже через 5 дней после инфицирования, т.е. за2 долго до появления антител к гепатиту С. Время появления anti2HCV различ2 но: в одних случаях – через 224 недели после начала гепатита, в других – че2 рез месяцы после повышения уровня аминотрансфераз. У ряда больных с самоограничивающимся течением инфекции anti2HCV никогда не появляют2 ся. Иммунологические тесты являются свидетельством HCV инфекции, тог2 да как только определение РНК ВГС позволяет различать активную инфек2 цию от прошедшей. Проведение ПЦР позволяет выявить РНК ВГС не толь2 ко в сыворотке крови, но и в биоптате печени, что важно при подтвержде2 нии роли ВГС в формировании гепатоцеллюлярной карциномы. У подобных больных РНК ВГС регистрируется в гепатоцитах и при отсутствии anti2HCV
иРНК ВГС в сыворотке крови. Вирус гепатита С отличается высокой измен2 чивостью и наличием нескольких вариантов генотипа. В лаборатории «Си2 нэво Украина» определяют субтипы ВГС: 1a, 1b, 2, 3a/b. Достоверным про2 гностическим фактором развития инфекции ВГС и ответа на противовирус2 ную терапию является генотип вируса гепатита С. Генотипом вируса также определяется продолжительность курса лечения, что весьма актуально, учитывая широкий спектр побочных действий противовирусных препаратов
инизкую переносимость данных препаратов больными. У пациентов с суб2 типом 1b хронизация HCV2инфекции происходит в 90% случаев, в то время как с генотипами 2а и 3а в 33250%. Инфицирование генотипом 1b сопровож2 дается более тяжелым течением заболевания, развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Пациенты с субтипом 3a имеют более вы2 раженный стеатоз и поражения желчевыводящих путей, а также более вы2 сокий уровень АлАТ, чем пациенты с HCV генотипа 1b. При этом уровень фиброза более выражен у пациентов с вирусом субтипа 1b. При монотера2
484
пии интерфероном устойчивый ответ наблюдается у 18% пациентов, инфи2 цированных HCV субтипа 1b, и у 55% – инфицированных другими генотипа2 ми. При комбинированной схеме лечения интерферон+рибаверин стойкий ответ наблюдается у 28% пациентов, инфицированных HCV субтипа 1b и у 66% пациентов, инфицированных другими генотипами.
Основные показания для назначения анализа:
1.Обнаружение РНК ВГС в случае хронического гепатита с отрицатель2 ными иммунологическими маркерами.
2.Мониторинг вирусемии.
3.Мониторинг проводимой противовирусной терапии.
4.Определение генотипа РНК ВГС.
Материал: венозная кровь.
Условия обработки и стабильность пробы: вакутайнер, содержащий ЭДТА.
Метод: Real2Time PCR.
Референтные значения в лаборатории «СИНЭВО Украина»:
1.РНК ВГС «не обнаружен».
2.Линейный предел составляет 200 МЕ/мл.
Коэффициент пересчета:
РНК ВГС (МЕ/мл) x 2,7 = РНК ВГС (копий/мл).
Интерпретация результатов:
1.Результат «не обнаружен» свидетельствует, что речь идёт об очень низ2
кой вирусемии (ниже линейного предела), об отсутствии вирусемии или об отсутствии обнаружения РНК ВГС.
2. Уровень вирусемии может коррелировать с иммунологическими марке2 рами, биохимическими для определения фазы хронической инфекции ВГВ.
Интерпретация результатов: получение положительного результата ука2 зывает на наличие активной инфекции. Мониторинг ответной реакции на лечение проводится через:
2 12 недель: ранний вирусологический ответ определяется как снижение количества РНК ВГС относительно базового уровня или необнаруживаемой виремии через 12 недель лечения;
2 6 месяцев после окончания лечения: устойчивый вирусологический от2 вет определяется как отсутствие обнаружения РНК ВГС через 6 месяцев после окончания лечения.
Продолжительность комбинированной терапии зависит от генотипа виру2 са. Пациенты, инфицированные ВГС с генотипом 1 или 4, независимо от уровня основной виремии, должны получать лечение в течение 48 недель.
Интерферирующие факторы: данный вид исследований действителен только для плазмы, отобранной с антикоагулянтом ЭДТА. Анализ других ви2 дов проб может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам. Содержание гепарина в крови может ингибировать протека2 ние метода ПЦР.
КОД 3064. ПЦР. Вирус гепатита C (Roche, Real time, количественное определение)
Материал: венозная кровь. Пробирка: вакутайнер с ЭДТА.
Метод: ПЦР в режиме Real2time количественный анализ. Анализатор: TaqMan248 (Roche Diagnostics, Швейцария).
485
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
Тест системы: Roche Diagnostics (Швейцария).
Аналитическая чувствительность тест системы: 25 МЕ/мл (68 копий/мл).
Коэффициент перерасчета: 2,7.
Линейный диапазон измерения: 25 МЕ/мл – 3,91 х 108 МЕ/мл.
Основные показания к назначению анализа:
Диагностика и мониторинг вирусного гепатита С.
Интерпретация результатов:
«Не обнаружена» – РНК вирусного гепатита С не выявлена, либо ее концентрация за пределами чувствительности тест2системы.
«Обнаружена»:
При определении значения МЕ/мл, которое находится вне границы линейного диапазона тест2системы, результат выдается как РНК HCV обнаружена, менее 25 МЕ/мл (68 копий/мл).
При определении значения, которое находится выше границы линейного диапазона тест2системы результат выдается как РНК HCV обнаружена более 3,91х108 МЕ/мл.
КОД 3080. ПЦР. Вирус гепатита TTV (качественное определение, Real time)
Впервые был обнаружен вирус TTV в 1997 г. у больных
посттранфузионными гепатитами и это расширило представление об этиологии ранее неясных заболеваний печени. Также доказана гепатотропность вируса путем выявления ДНК TTV в гепатоцитах больных острыми и хроническими гепатитами. К группе повышенного риска заражения TTV относят доноров крови (частота обнаружения – до 28%), больных на гемодиализе (до 32%), с многократными гемотрансфузиями (до 26%), наркоманов с внутривенным введением наркотиков (до 32%). К биохимическим особенностям моноинфекции TTV относят более высокую активность АЛТ, ЛДГ, ГГТФ и ЩФ. Морфологические изменения в ткани печени у больных, инфицированных TTV, представлены лимфоцитарной инфильтрацией портальных трактов, фокальными некрозами, фиброзом, изменениями желчных протоков и жировой дистрофией различной степени выраженности. Диагностика TTV2инфекции основывается на определении ДНК TTV и антител к вирусу в сыворотке крови. Появление анти2TTV совпадает с исчезновением ДНК, что позволяет рассматривать их как маркер перенесенной инфекции. Однако, несмотря на частое обнаружение TTV при хронических заболеваниях печени, его роль в развитии хронических гепатитов, циррозов печени и гепатоцеллюлярной карциномы пока не ясна.
Материал: венозная кровь. Пробирка: вакутайнер с ЭДТА.
Метод: ПЦР в режиме Real2time качественный анализ.
Анализатор: Амплификатор детектирующий ДТ296 (ДНК2Технология, Россия).
Тест системы: GenPak DNA2Fluo PCR test (Россия).
Аналитическая чувствительность тест системы: 1 х 103 копий/мл.
Основные показания к назначению анализа:
1.Клинические признаки острого и хронического гепатита, когда не обнаружены другие, распространенные виды вирусных гепатитов – В и С.
2.Выявление гепатита TTV у групп риска.
486
Интерпретация результатов:
«Не обнаружен» – в образце вирусная ДНК гепатита TTV отсутствует, либо ее концентрация вне предела чувствительности тест2системы.
«Обнаружен» – в образце присутствует ДНК вируса гепатита TTV
КОД 3041. ПЦР. Вирус гепатита D (кровь, качественное определение, Real timе)
Вирусный гепатит, вызванный вирусом гепатита D, называется также «дельта2вирусный гепатит». Часто пациенты заражаются одновременно вирусным гепатитом D и вирусным гепатитом В или у пациента с хроническим вирусным гепатитом В или носителя вирусного гепатита В возникает суперинфекция – заражение еще и вирусным гепатитом D. Вирус гепатита D мелкий, не имеет собственной оболочки и использует оболочку вируса гепатита В. Принадлежность этого вируса к какому2либо семейству вирусов не определена. Источник заражения – больной вирусным гепатитом D или носитель вируса. Пути передачи такие же, как и у вируса гепатита В – парентеральный, половой, трансплацентарный (от матери к плоду через плаценту). Наиболее подвержены заболеванию дети младенческого возраста, пациенты с хроническим гепатитом В и носители вируса гепатита В. Вирус гепатита D способен размножаться только в присутствии вируса гепатита В, поэтому острая дельта2инфекция протекает только в присутствии вируса гепатита В. Течение вирусного гепатита D похоже на течение вирусного гепатита В, но при присоединении дельта2вирусной инфекции течение болезни отягощается. Заболевание возникает через 1,52 6 месяцев после заражения. У пациента появляется повышение температуры тела до 38 градусов, слабость, ухудшение самочувствия, боли в суставах, особенно крупных, боли в области печени, тошнота и рвота. В желтушном периоде сохраняется повышение температуры тела, боли в области печени и все остальные проявления заболевания усиливаются. Могут появиться высыпания по типу аллергических. Увеличивается селезенка. Характерным признаком присоединения к вирусному гепатиту В коинфекции является двухфазное течение заболевания. Считается, что первая волна обострения обеспечивается размножением и выходом в кровь вирусов гепатита В, а вторая – размножением и выходом вирусов гепатита D. При присоединении дельта2инфекции значительно больше изменяются биохимические показатели крови: повышается билирубин, печеночные ферменты. Период реконвалесценции иногда затягивается. Хронизация процесса возникает в 427% случаев.
Материал: венозная кровь. Пробирка: вакутайнер с ЭДТА.
Метод: ПЦР в режиме Real2time качественный анализ. Анализатор: Амплификатор детектирующий ДТ296 (Россия). Тест системы: Ампли2Сенс (Россия).
Аналитическая чувствительность тест системы: 100 копий ДНК/мл.
Основные показания к назначению анализа:
Диагностика и мониторинг вирусного гепатита D.
Интерпретация результатов:
«Не обнаружен» – в образце вирусная ДНК гепатита Дельта отсутствует, либо ее концентрация вне диапазона чувствительности тест2ситемы.
«Обнаружен» – в образце вирусная ДНК гепатита Дельта присутствует.
487
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
IN VITRO
Диагностика аллергических заболеваний является сложным процессом, который включает анамнез, физическое обследование, методы исследова2 ний in vivo и in vitro. Аллергические реакции могут происходить в различных органах и в различных возрастных группах. Термин «аллергия» широко ис2 пользуется в медицинской и немедицинской сфере, зачастую неоправдан2 но. Вовлечение иммунологических механизмов является обязательным ус2 ловием, чтобы считать такие проявления у больных аллергическими, и отли2 чать их от других побочных реакций на продукты питания и медикаменты, где вовлечение иммунологических механизмов может не проявляться.
Определение основных терминов и понятий аллергии:
Атопические проявления (атопия) – индивидуальная или семейная склонность организма вырабатывать IgE2антитела в ответ на небольшое ко2 личество аллергенов, как правило, белков, что, как правило, проявляется типичными симптомами: астмы, риноконъюнктивита или экземы/дерматита. Термин «атопия» описывает данную клиническую предрасположенность и не должен использоваться для описания болезней.
Аллергия – реакция гиперчувствительности, вызываемая путем иммуно2 логических механизмов. У большинства пациентов антитела, отвечающие за аллергические проявления, – это антитела типа IgE, поэтому в таких слу2 чаях идет речь об IgE2зависимой аллергии. Существуют и другие виды ал2 лергии: IgE2независимая аллергия. К этому типу аллергии относится сыво2 роточная болезнь, аллергический альвеолит (IgG2зависимые заболевания), контактный дерматит (аллергия, опосредованная Т2лимфоцитами) и т.д.
Аллергены – это антигены, которые вызывают аллергические клиничес2 кие симптомы.
Гиперчувствительность – это воспроизводимые объективные симптомы или признаки, инициированные воздействием определенных стимулов, при2 сутствующих в допустимых количествах у здоровых лиц. Термин «гиперчув2 ствительность» используется как своего рода «зонтик», который включает, наряду с аллергическими реакциями, и другие проявления, к которым, как оказалось, не причастен иммунологический механизм, как, например, в слу2 чае гиперчувствительности к аспирину. Приведенное выше определение не включает в себя классические ответы на инфекции, аутоиммунитет и токси2 ческие реакции.
Возвращаясь к атипическим проявлениям, следует отметить, что это на2 следственное состояние. Например, риск развития у ребенка IgE2зависимой аллергии составляет 40260%, если оба родителя обладают атопией. У детей с высокой предрасположенностью IgE сенсибилизация и атопические забо2 левания проявляются уже в раннем возрасте. Аллергический фенотип про2 является по2разному в различные периоды жизни. Так, пищевая аллергия играет доминирующую роль в первые годы жизни. Клинические проявле2 ния, в основном, представлены атопическим дерматитом и желудочно2ки2 шечными симптомами. По мере увеличения частоты случаев пищевой ал2 лергии с возрастом, значительно увеличивается значение вдыхаемых ал2 лергенов с установлением симптоматики со стороны верхних и нижних ды2 хательных путей. Во многих случаях аллергический ринит можно считать предшественником астмы. У некоторых людей, которых нельзя отнести к ка2
488
тегории «пациентов с атопией» в детском и подростковом возрасте нивели2 руется сенсибилизация к обычным аллергенам, но позднее начинается раз2 витие IgE2зависимой аллергии, когда они подвергаются воздействию высо2 ких доз аллергенов, зачастую, при наличии адъювантов, таких как дым си2 гарет. Эта ситуация встречается наиболее часто в случаях профессиональ2 ной аллергии. При аллергии на яд насекомого и некоторые лекарственные препараты вовлекаются все IgE2зависимые механизмы, но страдают в рав2 ной степени как лица с атопией, так и без таковой.
Классификация аллергических заболеваний
1.Заболевания, связанные с реакцией гиперсенсибилизации немедленно2 го типа:
2 анафилактический шок;
2 ангионевротический отек Квинке;
2 крапивница.
2.Заболевания, связанные с реакцией гиперсенсибилизации замедленно2 го типа:
2 фиксированные медикаментозные стоматиты;
2 распространенные токсико2аллергические стоматиты (катаральный, ка2 тарально2геморрагический, эрозивно2язвенный, язвенно2некротический стоматиты, хейлиты, глосситы, гингивиты).
3.Системные токсико2аллергические заболевания:
2 болезнь Лайела;
2 многоформная экссудативная эритема;
2 синдром Стивенса2Джонсона;
2 хронический рецидивирующий афтозный стоматит;
2 синдром Бехчета;
2 синдром Шегрена.
Типы аллергических реакций
1.Аллергическая реакция I типа (реакция немедленного типа, анафи2 лактический, атопический тип). Она развивается с образованием антител2 реагинов, относящихся к классу IgE и lgG4. Они фиксируются на тучных клетках и базофильных лейкоцитах. При соединении реагинов с аллергеном из этих клеток выделяются медиаторы: гистамин, гепарин, серотонин, тром2 боцитактивирующий фактор, простагландины, лейкотриены и др., опреде2 ляющие клинику аллергической реакции немедленного типа. После контак2 та со специфическим аллергеном клинические проявления реакции возни2 кают через 15220 мин.
2.Аллергическая реакция II типа (цитотоксический тип). Тип характери2 зуется тем, что антитела образуются к клеткам тканей и представлены IgG
иIgM. Этот тип реакции вызывается только антителами, способными акти2 визировать комплемент. Антитела соединяются с видоизмененными клетка2 ми организма, что приводит к реакции активации комплемента, который также вызывает повреждение и разрушение клеток, с последующим фаго2 цитозом и удалением их. Именно по цитотоксическому типу происходит раз2 витие лекарственной аллергии.
3.Аллергическая реакция III типа (повреждение тканей иммунными ком2 плексами – тип Артюса, иммунокомплексный тип). Возникает в результате образования циркулирующих иммунных комплексов, в состав которых вхо2 дят IgG и IgM. Антитела этого класса называют преципитирующими, так как они образуют преципитат при соединении с антигеном. Этот тип реакции яв2 ляется ведущим в развитии сывороточной болезни, аллергических альвео2
489
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
литов, лекарственной и пищевой аллергии, при ряде аутоаллергических за2 болеваний (СКВ, ревматоидный артрит и др.).
4.Аллергическая реакция IV типа, или аллергическая реакция замед2 ленного типа (гиперчувствительность замедленного типа, клеточная гипер2 чувствительность).
При этом типе реакций роль антитела выполняют сенсибилизированные Т2лимфоциты, имеющие на своих мембранах рецепторы, способные специфи2 чески взаимодействовать с сенсибилизирующими антигенами. При соедине2 нии лимфоцита с аллергеном выделяются медиаторы клеточного иммунитета – лимфокины. Они вызывают скопление макрофагов и других лимфоцитов, в результате чего возникает воспаление. Одной из функций медиаторов являет2 ся вовлечение их в процесс разрушения антигенов (микроорганизмов или чу2 жеродных клеток), к которым сенсибилизированы лимфоциты. Реакции за2 медленного типа развиваются в сенсибилизированном организме через 24248 часов после контакта с аллергеном. Клеточный тип реакции лежит в ос2 нове развития вирусных и бактериальных инфекций (туберкулез, сифилис, ле2 пра, бруцеллез, туляремия), некоторых форм инфекционно2аллергической бронхиальной астмы, ринита, трансплантационного и противоопухолевого им2 мунитета. Патогенез аллергических реакций замедленного типа обусловлен взаимодействием сенсибилизированных лимфоцитов со специфическим ал2 лергеном. Образующиеся медиаторы клеточного иммунитета воздействуют на макрофаги, вовлекают их в процесс разрушения антигенов, против которых сенсибилизированы лимфоциты. Клинически это проявляется развитием ги2 перергического воспаления: образуется клеточный инфильтрат, клеточную ос2 нову которого составляют мононуклеары – лимфоциты и моноциты. Мононук2 леарная инфильтрация выражена вокруг малых кровеносных сосудов. Нужно отметить, что для данного аллергического воспаления наиболее характерна фибриноидная дегенерация. Аллергическое воспаление регулируется нервной системой, и интенсивность его зависит от реактивности организма.
В дальнейшем речь пойдет только о IgE2зависимой аллергии, так как лабо2 раторные тесты предназначены для ведения учета аллерген2специфических IgE. Возникновение заболеваний или аллергических синдромов требует уча2 стия, с одной стороны, «предрасположенных» лиц, а во2вторых, определен2 ных агентов окружающей среды, почти всегда называемых аллергенами.
По пути проникновения аллергены можно разделить на:
1.Пневмоаллергены (пыльца, домашняя пыль, воздух, грибки, шерсть и эпидермис животных).
2.Пищеварительные и пищевые аллергены (яичный белок, коровье моло2 ко, клубника, земляника и т.д.).
3.Аллергены2насекомые (яды насекомых).
4.Лекарственные аллергены.
5.Химические аллергены (профессиональные или непрофессиональные). Пневмоаллергенами являются:
А. Пыльца, содержащаяся в воздухе. B. Споры аллергенных грибков.
C. Домашняя пыль.
D. Шерсть и эпидермис животных.
Пыльца является атопическим аллергеном, отвечающим, в зависимости
от страны и местности, за возникновение относительно большого числа ин2 термиттирующих ринитов, риноконъюнктивитов и бронхиальной астмы. Как правило, растения, содержащие аллергенную пыльцу, делятся на: злако2
490