стандарты лечения / Laboratornyi-Spravochnik-2012__Synevo
.pdf
КРИТЕРИИ ОТКАЗА ОТ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Лаборатория«СИНЭВО» оставляет за собой право отказать в приеме не2 корректных биологических проб. Лаборатория «СИНЭВО» допускает, что существуют ситуации, при которых приходится работать с определенными нетипичными образцами, которые получены в результате инвазивных ма2 нипуляций, или возникают трудности при взятии проб. В подобных случаях бывают исключения из строгих правил относительно отказа в приеме проб. Исключения могут быть, в зависимости от сложившихся ситуаций в ходе работы.
Общие критерии для отказа приема проб
1.Пробы, собранные в несоответствующие транспортные кон тейнеры или содержащие несоответствующие консерванты: в
случае взятия материала в несоответствующие пробирки или со2 держащие несоответствующие консерванты, которые могут приве2 сти к ошибочным результатам.
2.Недостаточное количество материала: при получении недоста2 точного количества биологического материала (моча, кровь и т.д.) необходим повторный забор, учитывая правила забора, при кото2 ром необходимо взять достаточный объем материала для исследо2 вания. Если возникли сложности при обработке приносного мате2 риала для исследования (соскоб, ликвор, кровь и др.) то в этом слу2 чае оповещается врач, проводивший забор пробы и вместе с ним устанавливаются необходимые исследуемые лабораторные пара2 метры.
3.Неправильно отобранные образцы: при получении материала, отобранного в несоответствии с проводимыми исследованиями (например, слюна вместо соскоба или моча для анализов крови и т.д.), его оформляют в перезабор. Лабораторный центр, где прово2 дилось взятие материала, оповещают через информационную службу лаборатории и предлагают провести повторный забор проб.
4.Неправильно транспортированные или хранившиеся пробы:
если время транспортировки материала в лабораторию превышает допустимый интервал времени согласно требованиям, которые предоставляют производители реагентов. Также оформляются в перезабор и биологические материалы, которые нуждаются в ох2 лаждении, а транспортировались при комнатной температуре, так2 же как и пробы, нуждающиеся в заморозке, а доставленные в ла2 бораторию в размороженном виде.
5.Гемолизированные пробы: некоторые исследования являются не2 корректными при наличии гемолиза in vitro. При гемолизе сыворот2 ки информационная служба лаборатории связывается с врачом, направившим материал, или пациентом, и предлагают провести по2 вторный забор материала. Информирование врача, который напра2 вил материал, особенно в случае тяжелых госпитализированных пациентов, является обязательным с целью исключения редких случаев гемолиза in vivo.
31
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ РАБОТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ЛАБОРАТОРИИ «СИНЭВО»
1. Проточная цитофлуорометрия.
Количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула определяются после ли2 зиса эритроцитов с помощью проточной цитофлуорометрии, которая позволя2 ет анализировать физические и химические свойства клеток, при которой проба крови всасывается и разводится. Проба крови всасывается, разбавля2 ется и окрашивается. Клетки крови затем выстраиваются в линию по одному, проходя через центр проточной камеры, в то время как лазерный луч, излуча2 емый полупроводником, попадает на них и в результате рассеивается в раз2 личных направлениях. Свет, рассеянный фронтально, улавливается фотоди2 одом и позволяет определить объем клетки. Свет, рассеянный латерально, дает информацию о компонентах клетки (ядре и гранулированных элемен2 тах), а латеральный флуоресцирующий свет информирует о величине клеточ2 ной ДНК и РНК. Свет, рассеянный латерально и флуоресцирующий латераль2 но, принимается трубкой фотомультипликатора. В конечном результате ана2 лизатор отображает два двумерных изображения:
2 на «4DIFF» (X2ось отражает интенсивность латерального света, а Y2ось – интенсивность флуоресцирующего латерального света) появляются 5 лей2 коцитарных форм и группа теней эритроцитов;
2 на «WBC/BASO» (X2ось отражает интенсивность латерального света, а Y2ось – интенсивность фронтального света) появляются формы базофилов
иостальные формы лейкоцитов, и также эритроцитарные тени.
Показатели анализируемых проб:
а) эритроцитарные:
•количество эритроцитов,
•гемоглобин,
•гематокрит,
•эритроцитарные индексы:
2 средний объем эритроцитов,
2 среднее содержание гемоглобина в эритроците,
2 средняя концентрация гемоглобина,
2 ширина распределения эритроцитов; б) лейкоцитарные:
•общее количество лейкоцитов,
•лейкоцитарная формула в относительных (%) и абсолютных величи2 нах;
с) тромбоцитарные:
•количество тромбоцитов,
•тромбоцитокрит,
•средний объем тромбоцитов,
•ширина распределения тромбоцитов.
Анализатор непосредственно подсчитывает количество лейкоцитов и лей2 коцитарную формулу, количество эритроцитов, гемоглобина, гематокрит и количество тромбоцитов. Кроме гемограммы и двух изображений, прибор отображает две гистограммы для эритроцитов и тромбоцитов, которые по2 казывают количество клеток и их распределение, в зависимости от объема. Гематологический анализатор также может выявить аномальные или незре2
32
лые клетки, отображая это в виде различных предупреждений при анор2 мальной локализации формирований клеток на «WBC/BASO» или «4DIFF», таких как:
Лейкоциты
Патологические изменения
2нейтропения
2нейтрофилия
2лимфопения
2лимфоцитоз
2моноцитоз
2эозинофилия
2базофилия
2лейкопения
2лейкоцитоз Подозрение на:
2бластные формы
2незрелые гранулоциты
2сдвиг влево
2атипичные лимфоциты
2ядерные предшественники эритроцитов
Основные параметры
Neut%
Neut%
Limf%
Limf%
Mono%
Eo%
Ba%
Le%
Эритроциты
Патологические изменения |
Основные параметры |
|
2 |
эритроцитарный диморфизм |
RDW2SD |
2 aнизоцитоз |
RDW2CV |
|
2 |
микроцитоз |
VEM |
2 |
макроцитоз |
VEM |
2 |
гипохромия |
CHEM |
2 |
анемия |
Hb |
2 |
эритроцитоз |
Количество эритроцитов |
Подозрение на: |
СHEM |
|
2 |
агглютинацию эритроцитов |
HEM |
2 |
интерференцию с |
VEM |
определением Hb |
RDW2CV |
|
2 |
дефицит железа |
|
2 |
дефект Hb |
|
2 |
эритроцитарные фрагменты |
|
|
|
|
Эритроциты
Патологические изменения |
Основные параметры |
|
|
|
|
2 |
тромбоцитопения |
Количество эритроцитов |
2 |
тромбоцитоз |
|
2 |
агглютинация тромбоцитов |
|
|
|
|
2. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов.
Автоматический анализатор, работающий на основе проточной цитофлу2 орометрии с применением флуоресцентного или лазерного полупроводни2 ков. Также может проводить исследование следующих параметров:
33
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
•процент ретикулоцитов,
•абсолютное число ретикулоцитов,
•процент незрелых ретикулоцитов.
Принцип работы метода
Отбирается образец крови путем аспирации, разбавляется и окрашивает2
ся суправитально, что способствует преципитации остаточных нуклеопроте2 идов из незрелых эритроцитов. Далее проба подвергается исследованию в оптической системе, где анализируется при помощи проточной цитофлуоро2 метрии на базе полупроводникового лазера. В результате получаем изобра2 жение, где ось X представляет латеральную флуоресцентную интенсив2 ность, и ось Y – свет, рассеянный фронтально, и при этом вырисовываются три группы: группа зрелых эритроцитов, группа ретикулоцитов и группа тромбоцитов, где ретикулоциты рассчитываются по формуле:
Rt% = |
Частицы из Рк |
х 100 |
Частицы из зоны зрелых Эр. + частицы из зоны Рк |
Rt (абс. числа) = |
Rt% х кол2во Er |
|
100 |
||
|
3. Определение СОЭ.
1. Ручной метод Вестергрена (Westergren).
Поставить пробирку в вертикальном положении в держатель с градацией в один миллиметр и определить уровень седиментации красных кровяных кле2 ток в мм/час. В некоторых тестах результат рассчитывают с интервалом в 2 ча2 са, но такой способ подсчета не дает никакой дополнительной информации.
2. Автоматизированный метод.
Осуществляется на автоматических анализаторах (СОЭ2мер), контроли2 руемых микропроцессором, измеряющим скорость оседания красных кро2 вяных клеток (СОЭ) с помощью системы инфракрасных лучей. Одновремен2 но могут быть исследованы 402160 проб в час, в зависимости от количества используемых модулей. Седиментация происходит при комнатной темпера2 туре под воздействием гравитации, и результаты выражаются в мм/час, со2 гласно методики Westergren. Так как результаты должны быть воспроизво2 димыми, необходимо, чтобы высота столбца крови из трубки для отбора проб составляла не менее 5215 мм от максимального наполнения трубки.
4. Определение показателей гемостаза.
Осуществляется на полу2 или автоматических анализаторах, принципом работы которых является коагулометрия для гемостаза и протеина S, а так2 же колориметрия для антитромбина III.
Для внутреннего контроля качества используются две контрольные плаз2 мы: плазма с нормальными показателями и одна – с патологическими зна2 чениями, обеспечивая ежедневный мониторинг точности и достоверности расчетов. Из колориметрических методов исследований используется ме2 тод, состоящий в измерении абсорбции монохромного света (с длиной вол2 ны 405 нм или 540 нм), который проходит сквозь кювету, где происходит ре2 акция формирования хромофорного вещества. Показатель абсорбции пря2 мо пропорционален уровню антитромбина III в исследуемой плазме.
34
5.Методы определения общих биохимических показателей, специ фических белков.
Турбидиметрия и нефелометрия: основывается на формировании ком2 плекса антиген2антитело в растворе. Растворы антигена и антитела смеши2 ваются, при этом реактив используется в очень малых количествах, а фор2 мирование агрегатов происходит быстро. Турбидиметрия измеряет количе2 ство непреломленного света, прошедшего через раствор. Фотосенсор рас2 положен на прямой линии с источником света, абсолютно прозрачный рас2 твор пропускает до 100% света, чем выше концентрация частиц, тем мень2 ше проходит света. Нефелометрия измеряет количество рассеянного под прямым углом по отношению к лучу света, фотосенсор расположен под уг2 лом 90° к источнику освещения, абсолютно прозрачный раствор не прелом2 ляет свет. Поэтому нефелометрические измерения выявляют рост выше уровня нуля (в особенности турбидиметрия, выявляющая снижение переда2 чи до 100%), нефелометрия наиболее чувствительна к малым концентраци2 ям исследуемых веществ. Поэтапная нефелометрия представляет собой ки2 нетическое измерение формирования агрегатов. Время, за которое изгиб кривой «диспергированный свет – время» является максимальным и про2 порционален концентрации антигена. Использование турбидиметрии и не2 фелометрии: определение альбуминемии и микроальбуминурии, иммуно2 глобулинов IgА, IgG, IgM и фракций комплемента C3, C4.
ИСЭ (ион селективные электроды): ион2селективный электрод являет2 ся трансдуктором (сенсором), преобразующим активность определенного иона, находящегося в растворе, через мембрану в электрический потенци2 ал, который может быть измерен с помощью вольтметра или pH2метром. Мембрана расположена у края пробирки, содержащей внутренний элек2 трод. Изменение потенциала измеряется электродом, расположенным из2 вне, с постоянным потенциалом. Разница потенциалов между двумя элек2 тродами зависит от активности иона в растворе, которая связана с концен2 трацией соответствующего иона, на основании которой и осуществляется анализ. ИСЭ работает по принципу гальванической клетки: потенциал клет2 ки эквивалентен потенциалу ИСЭ минус потенциал референс2электрода. Определения ИСЭ не подвержены воздействию интерференции так, как цвет пробы. Источники погрешностей – это взаимодействие с другими иона2 ми, по свойствам схожими с исследуемым ионом, разница в степени диф2 фузии ионов – в зависимости от их размеров.
Реакции латекс агглютинации: являются серологическими реакциями, основанными на реакции антиген2антитело – микрочастицы латекса, покры2 тые молекулами антиген/антитело агглютинируют, в результате связывания
сантителом соответствующего антигена из исследуемой сыворотки. Ла2 текс2агглютинация была адаптирована для количественных исследований, использующих турбидиметрию/нефелометрию, обеспечивая повышение чувствительности.
6.Автоматизированные методы определения иммунологических маркеров.
Широкий спектр эндокринных, опухолевых, инфекционных, сердечных, костных, аллергологических и аутоиммунных маркеров определяется в ла2 боратории «СИНЭВО» автоматизированными методами, в основе которых лежит реакция антиген2антитело и методы называются иммунохимическими (аналог термина «immunoassay» в специализированной английской литера2
35
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
туре). Специфическое распознавание между антигеном и антителом, харак2 терное для иммунологических тестов, получило широкое распространение в качестве аналитического метода. Иммунохимические тесты используются для определения и антигенов, и антител. Чувствительность иммунологичес2 ких методов повысилась за счет развития новых систем приема сигналов и технологий с твердой фазой с твердой фазой, что позволило проводить определение уровня менее 0,1 пг/мл антигена, присутствующего в крови. Они могут применяться как для малых молекул (гаптены), так и для макро2 молекулярных белковых комплексов, а также для определения антител к ал2 лергенам, инфекционным возбудителям, автологических антигенов. Основ2 ная характеристика иммунохимических тестов состоит в маркировке анти2 гена или антитела веществом, генерирующим сигнал, который можно изме2 рить, осуществляя детекцию комплекса антиген2антитело. В зависимости от типа этих веществ, иммунохимические тесты классифицируются следую2 щим образом:
2 радиоиммунологические тесты: используется маркировка радиоизотопа2 ми (125I, 131I, 3H, 14C, 32P),
2 иммуноферментные тесты: используется маркировка ферментами,
2 иммунохимический тест с детекцией с помощью флюоресценции: исполь2 зуется маркировка при помощи флуоресцентных молекул (флюорохромов), 2 иммунохимические тесты с детекцией за счет хемилюминесценции: ис2 пользуется для маркировки молекул, которые генерируют хемилюминесцен2 цию, такие как производные люминола, акридиновые эфиры, производные
нитрофенил оксалата.
Одним из вариантов иммунохимических тестов является детекция за счет электрохемилюминесценции (ЭХЛМ, ECLIA), которая используется для мар2 кировки определенных органических соединений (соединения рутения, ос2 мия и т.д.), генерирующих электрохимическое свечение.
7. Иммуноферментные методы.
Этот тип тестов использует маркировку ферментами, которые представ2 ляют альтернативу радиоизотопному методу. Наиболее часто используемы2 ми тестами являются ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), EIA (иммуноферментный анализ), EMIT (радиоиммунологический анализ с ферментативным усилением). Тесты EIA нуждаются во вторичном процессе для получения сигнала в результате каталитического действия фермента. В качестве твердой фазы для отделения свободного конъюгата от связанного могут использоваться пластинки с ковшиками, пластиковые шарики, плас2 тиковые трубки, магнитные частицы или латекс с фильтрами. Использова2 ние магнитных частиц или латекса обеспечивает сокращение времени реак2 ции. Наиболее часто используемыми ферментами являются пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза, глюкозооксидаза, уреаза и каталаза. Выбор используемого фермента определяется субстратом для распознавания.
EIA колориметрический: используются хромогенные субстраты, такие как 32этил2бензотиазолин262сульфонат, который образует с перекисью во2 дорода под действием пероксидазы зеленый цвет, или n2нитрофенилфо2 сфат, образующий желтый цвет под действием щелочной фосфатазы.
EIA с хемилюминесценцией (CLIA) используют хемилюминесцентные субстраты, которые взаимодействуют с различными ферментами, использу2 емыми для маркировки, ферментная хемилюминесцентная реакция генери2
36
рует свет. Настоящие системы используют производные люминола с перок2 сидазой и перекисью водорода (или другая ферментативная система, кото2 рая генерирует перекись водорода как, например, глюкозоксидаза или ури2 каза) плюс потенциатор (производные фенола как, например, n2йодофе2 нол), который увеличивает эмиссию света до 3000 раз. Окислительные ре2 акции люминола могут быть представлены огромным количеством интер2 ференций, которые увеличивают неспецифический сигнал. Другая система использует щелочную фосфатазу и производное адамантилдиоксиэтана (AMPPD), которое не требует других молекул для эмиссии света, в отличие от люминола, которому необходимы окислительные соединения. AMPPD яв2 ляется сложным субстратом, образованным из одной группы адамантила, играющим роль стабилизатора целой молекулы, связь диоксетана – как ис2 точника энергии, фосфорилэстер – как место для энзимного расщепления и фенил группа – для хемилюминесценции. Этот новый субстрат сделал воз2 можным развитие исследований сверхвысокой чувствительности выше, чем
висследованиях RIA по чувствительности приблизительно 0,1 пг/мл, време2 ни и простоте выполнения. EIA, как и RIA, может быть разделена на конку2 рентные исследования (с избытком исследуемого вещества, используя ан2 тиген2ферментный конъюгат) и неконкурентные (с реагентом в избытке), ко2 торые включают иммунометрические тесты «сэндвич» для определения ан2 тигена (гормоны, онкомаркеры, инфекционные агенты, белки плазмы) и не2 прямые тесты для определения антител (анти HVC, аутоантитела). Преиму2 щества иммуноферментных тестов заключаются в разработке чувствитель2 ных исследований с помощью эффекта амплификации ферментов. Реакти2 вы являются стабильными, отсутствует радиологический риск, как и недо2 статки. Измерение ферментной активности может быть более сложным, чем измерение активности некоторых радиоизотопов, но ферментативная ак2 тивность может быть обусловлена составляющими ингредиентами сыворот2 ки.
ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ): является чувствитель2 ным методом, поскольку каждая молекула фермента может преобразовы2 вать многие молекулы субстрата, выступающие в качестве усилителя реак2 ции. Энзимы вырабатывают продукты окрашивания, которые осаждаются, так как они не диффундируют из места образования. Антиген связан с твер2 дой поверхностью, первичное антитело связывается с антигеном, а вторич2 ное энзим2меченное антитело связывается с первичным антителом. Энзим превращает субстрат в окрашенный конечный продукт, который образует преципитат пропорционально количеству антител из сыворотки пациента. Метод ELISA тип «сэндвич» с присоединенным антигеном увеличивает спе2 цифичность методики, требуя связывания антитела с двумя различными эпи2 топами (могут происходить перекрестные реакции в одном из эпитопов, но существует возможность произойти в двух эпитопах одновременно). Моно2 клональное антитело связывается на твердой поверхности и связывает анти2 ген, если оно присутствует в сыворотке пациента. Несвязанный материал промывается, одно их двух маркированных антител, которое распознает чу2 жой эпитоп, связывается с антигеном, новое промывание разделяет несвя2 занные антитела, затем присоединяет к субстрату, который превращает в ок2 рашенный продукт пропорционально количеству антигена, присутствующего
висследуемой сыворотке. Метод ELISA конкурентного типа состоит в следу2 ющих этапах: внутренняя поверхность микропластинки покрыта антителами
37
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
с точно оттитрованной концентрацией. Антиген из пробы и энзим2меченный антиген из конъюгата «конкурирует» в одной реакции для ограниченного ко2 личества мест из иммобилизированного антитела, после разделения конъю2 гата присоединяется хромогенный субстрат. Окрашенный продукт в резуль2 тате реакции обратно пропорционален количеству антигена из пробы.
Термин «авидность» или «функциональное родство» относится к группе антител и определяет фактическую силу связывания антигена. Авидность антител IgG является сниженной при первичных инфекциях, но увеличивает2 ся постепенно в течение недель или месяцев, как результат деятельности В2клеток, способных вырабатывать специфические иммуноглобулины. Нали2 чие антител иммуноглобулинов IgG в повышенном титре указывает на факт перенесенной инфекции минимум 4 месяца назад, в то время как сниженный индекс авидности наводит на мысль о недавно перенесенной инфекции.
Иммунохимические тесты с определением при помощи электрохемилюми2 несценции основываются на использовании комплекса рутения (II)2три (би2 пиридил) [Ru(bpy)3]2+ с трипропиламином (TPA), который генерирует элек2 трохимический свет, в связи с циклом окислительно2восстановительных ре2 акций: Ru(bpy)32+ имеет реактивный участок для связывания с исследуе2 мым веществом, используется агент активатор, такое как N2гидроксисукци2 нимид (NHS), так как он легче связывается с аминогруппами белков, гапте2 нов или нуклеиновых кислот, что дает возможность применять данный ме2 тод к различным исследуемым веществам. Эмиссия света провоцируется электрическим импульсом иммунного комплекса (который содержит соеди2 нение рутения) фиксированного на микрочастицах, обернутых в стрептови2 дин. Преимущество электрической инициации хемилюминесцентной реак2 ции состоит в том, что она на всем протяжении может точно контролиро2 ваться. Существуют три основных принципа данного метода:
принцип «сэндвича»: сначала проба пациента перемешивается с анти2 телами, связанными с биотином и антителами, связанными с рутением, пос2 ле инкубирования смеси добавляются парамагнетические микрочастицы, обернутые стрептавидином (твердая фаза). После второго инкубирования реакционная смесь аспирируется в измерительную камеру, а свободный конъюгат удаляется. В дальнейшем используется электрический ток для возбуждения рутения и генерации сигнала, позволяющего выявить ком2 плекс антиген2антитело, количество вырабатываемого света прямо пропор2 ционально количеству антигена в пробе;
конкурентный принцип: изначально перемешивается исследуемое ве2 щество и антиген, связанный с биотином. После первичной инкубации до2 бавляются антитела, связанные с соединением рутения, и парамагнитные микрочастицы, обернутые с стрептавидином. Конъюгированные антитела связываются с еще не занятыми участками антигенов, связанных с биоти2 ном, а весь комплекс связывается с микрочастицами за счет взаимодей2 ствия биотина со стрептавидином. После второй инкубации реактивная смесь проходит в измерительную камеру, иммунные комплексы иммобили2 зированы магнитным методом на поверхности электрода, а несвязанные компоненты удаляются путем вымывания. Хемилюминесцентная реакция стимулируется электрически, а количество вырабатываемого света обратно пропорционально количеству антигена;
38
принцип «bridging»: схож с принципом «сэндвича», но направлен на оп2 ределение антител и включает антиген, связанный с биотином, и антиген помеченный рутением.
8. Другие методы, используемые для проведения иммунологических
исерологических тестов.
Реакция агглютинации: клетки или частицы связаны друг с другом за счет
взаимодействия антиген2антитело. Антиген или антитело, прикрепленные к частицам, будь это эритроциты, латекс или металлические частицы, взаимо2 действуют с исследуемым веществом из пробы; как результат иммунной ре2 акции, частицы представляют существенную агглютинацию, которая видна невооруженным глазом. Гаптен с единственным участком для связывания не может присоединиться, так как фиксируется твердой фазой. Реакции агглю2 тинации являются очень чувствительными: маленькое количество антител мо2 жет агглютинировать с большим количеством частиц. Также они являются очень быстрыми, протекая за несколько минут. Благодаря чувствительности (~5 нг/мл) и быстроте широко используются в практике. Прямая/пассивная аг2 глютинация используется для детекции специфических антител с антигенами; обратная агглютинация используется для детекции растворенных антигенов в пробе с соответствующими антителами. Реакции агглютино2ингибирования основываются на конкурентном принципе, в котором агглютинация частиц, связанных с гаптенами ограниченным количеством антител, подавляются свободным гаптеном, содержащимся в образце исследуемого вещества.
Гемагглютинация представляет собой агглютинацию эритроцитов, вы2 званную антителами. Будучи пентамерной молекулой, иммуноглобулин Ig M является лучшим гемагглютиногеном, чем Ig G.
Пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, в которых анти2 ген был присоединен химическим способом; агглютинация выявляет антите2 ла к соответствующим антигенам. Например, группа АВ0 или ТРНА (тест ге2 магглютинации на Treponema pallidum).
Обратная пассивная гемагглютинация: используются эритроциты, к кото2 рым были присоединены антитела; они агглютинируются антигенами.
Агглютинация частиц желатина и других синтетических частиц: используют2 ся специальные неантигенные частицы, которые устраняют проблемы, связан2 ные с наличием гетерофильных антител в ходе использования эритроцитов как частиц; могут заменить любой тест, основанный на гемагглютинации, за исключением тестов, использующих эритроциты из исследуемой пробы как частицы. Обеспечивают более чувствительную детекцию, чем при использова2 нии клеток крови. Концентрация антител может определяться путем титрова2 ния: осуществляется серийное разведение сыворотки; в каждом разведении концентрация антител уменьшается в два раза. В определенном разведении не существует достаточной концентрации антител, которые связывались бы со всем антигеном полностью; титр антител представляет фактор разведения в последней пробирке, где произошла полная реакция, например:
Пробирка |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
Разведение |
1 |
1:2 |
1:4 |
1:8 |
1:16 |
1:32 |
1:64 |
1:128 |
1:256 |
1:512 |
Агрегация |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
2 |
2 |
2 |
Результат: титр = 1:64
39
ЛАБОРАТОРНЫЙ СПРАВОЧНИК СИНЭВО
Реакция может быть ингибирована при повышенной концентрации анти2 тел. Ингибиторы обычно представлены в малых концентрациях. По мере растворения ингибитора, реакция становится положительной. Результат из2 начально отрицательный, называется «прозона».
Реакции преципитации: комплекс антиген2антитело образует видимый преципитат, который можно определить качественно невооруженным взглядом или количественно при помощи детектора. Формирование пре2 ципитата нуждается в формировании крупных молекулярных агрегатов путем связывания антигена с антителом. Малые комплексы остаются рас2 творенными. Для формирования больших комплексов и антитела, и анти2 гены должны быть поливалентными. Концентрация преципитата зависит как от абсолютной концентрации антигена и антитела, так и от их относи2 тельной концентрации. Если антитело или антиген находятся в избытке относительно друг друга, образуется малое количество растворимых ком2 плексов, преципитат уменьшается количественно или отсутствует, и, со2 ответственно, антитела или антигены остаются свободными в растворе. При приблизительно равных количествах антител и антигенов начинается формирование преципитата. Соотношение концентраций, при которых образуется максимальное количество преципитата и ни антитела, ни ан2 тигены не остаются в растворе, и являются точкой эквивалента. Другие условия, такие как температура, рН, ионное насыщение раствора, срод2 ство и авидность антител также являются важными в формировании им2 мунного преципитата.
Иммунноэлектрофорез: первоначально осуществляется электрофорети2 ческое разделение сывороточных белков в гель2агаре, далее антитела раз2 мещаются в бороздке в агаре. Антитела и белки диффундируют друг к дру2 гу и формируют дуги преципитации; различные белки могут идентифициро2 ваться специфическими антителами. Если специфические антитела распре2 делены по всей поверхности геля, то формируется полоска преципитации.
5.7 Методы, используемые в микробиологии.
Быстрое выявление микроорганизмов и изучение морфологии, необходи2 мой для микробиологической диагностики, осуществляется путем микро2 скопического исследования.
Микроскопическое исследование может быть свежим, между предметным
ипокровным стеклами или зафиксированным и окрашенным.
Под мазком понимается микробный материал (патологический материал
или микробная культура), размещенный в тонком слое на поверхности пред2 метного микроскопического стекла. Для создания мазка используются мик2 роскопические чистые и обезжиренные стекла, которые маркируются име2 нем пациента с одного края и названием микробиологического материала, который необходимо выявить, с другого.
Для каждого патологического материала делается 2 мазка (исключением являются пункционные жидкости, из которых делают 4 мазка), один окраши2 вается по Граму (для выявления бактерий), а второй – Giemsa (для опреде2 ления клеточной специфичности).
Мазок из патологического материала носит название окрашенного микро2 скопического исследования и имеет очень важное значение для медицин2 ской бактериологии. Она применяется для следующих целей:
2 быстрая ориентировка в диагнозе при неотложных состояниях (пример: бактериальный менингит);
40