2. Определение групп крови

Общие сведения. Успехи трансфузионной терапии тесно связаны с успехами изосерологии — науки об антигенах, антителах и группах крови. К. Ландштейнер, изучая серологические свойства крови, установил, что эритроци­ты человека содержат антигены человека. Одновременно с этим открытием им была выявлена строго абсолютная закономерность содержания в плазме крови естественных антител: против эритроцитарного антигена у данного человека в плазме никогда не бывает соответствующего плазменного антитела.

На основании этих данных Ландштейнер в 1901 г. ввел понятие о групповой принадлежности крови и разделил всех людей по серологическим особенностям эритроцитов на три группы. В 1907 г. Я. Янский доказал, что у людей закономерно встречаются четыре группы крови.

В 1910 г. предложили назвать антигены эритро­цитов человека агглютиногенами А и В, а соответствующие антитела анти А и анти В — агглютининами α и β.

В 1928 г. была принята классификация групп крови по Янскому:0(I), А(II),B(III),AB(IV).

В основе определения групп крови лежит реакция изогемагглютинации, т. е. реакция взаимодействия антител плазмы с соответствующими антигенами эритроцитов, вследствие которой наблюдается склеивание эритроцитов в виде зерен или песчинок.

Агглютиногены и агглютинины крови.

Агглютиногены крови, по структуре полисахариды, локализуются в оболочке клеток крови. В настоящее время в крови человека обнаружено более 100 различных агглютиногенов, которые группируются в антигенные системы: системаABO,Rh-hr,MN, Р, Даффи, Льюис и др.

Оценивая клиническое значение различных агглютиногенов, следует выделить основные: антигены системы АВО и Резус-фактор, которые чаще всего бывают причиной посттрансфузионных осложнений. Поэтому указанные факторы всегда учитываются при переливании крови. Возникновение осложнения при совместимости данных фак­торов указывает на несовместимость крови донора и реципи­ента по другим системам. В таких случаях требуется инди­видуальный подбор крови донора, который должен произ­водиться в отделении или на станции переливания крови.

Агглютиноген «0» является слабым антигеном и выяв­ляется только специальными сыворотками. Даже при по­вторном введении его в организм антител к нему практиче­ски не образуется.

Агглютининыпредставляют собой гамма-глобулины (иммуноглобулины) плазмы крови. Агглютинины делят на естественные — генетически обусловленные, существующие в течение всей жизни, например антитела анти А и анти В, и иммунные, которые появляются у людей в результате иммунизации чужеродными агглютиногенами, например антитела анти-Резус.

Итак, под группами крови подразумевают определённые различные сочетания взаимосвязанных антигенов (агглютиногенов) эритроцитов и антител (агглютининов) плазмы крови.

В табл. 3. представлены основные агглютиногены и агглютинины системы АВ0, характеризующие серологические особенности каждой из четырёх групп крови.

Таблица 3. Агглютиногены и агглютинины, характерные для каждой группы крови

Группа крови по системе АВ0	Агглютиногены эритроцитов	Агглютинины плазмы
0(I)	0	α β
А(II)	А	β
В(III)	В	α
AB(IV)	АВ	—

По данным М. А. Умновой (1964), среди населения чаще встречается А(II) группа крови — 37,8%, затем 0(I) — 33,5%, реже В(III) иAB(IV) — 8,2%. Групповые особенности крови человека являются его постоянным признаком; они возникают во внутриутробном периоде развития, сохраняются в течение всей жизни и передаются по наследству.

Если при переливании крови у человека произойдет встреча одноименных агглютиногенов и агглютининов (А и α, В и β), то возникает агглютинация, а затем гемолиз эритроцитов, что является тяжелым осложнением, которое нередко заканчивается летальным (смертельным) исходом.

Система Резус. Учащение переливания крови в период, когда существование групп крови по системе АВ0 уже было известно, но не была еще открыта система «Резус», сопровождалось ростом числа посттрансфузионных осложнений, возникавших, несмотря на переливание крови, совместимой по группам АВ0. Причина этих реакций была определена Ландштейнером и Винером (1937— 1939). Они установили, что введе­ние эритроцитов макак вида «Резус» кроликам сопровож­дается выработкой у последних антител, которые агглютинируют в 100% случаев эритроциты обезьян «резус».

Ввиду этого, указанные антитела назвали антителами антирезус. Затем было установлено, что сыворотка крови этих кроликов, содержащая антитела антирезус, агглютинирует эритроциты 85% людей белой расы. Эритроциты 15% людей этой расы такой сывороткой не агглютинируются. Из этого сделан вывод, что у 85% людей эритроциты содержат антиген «Резус» (Резус-фактор), свойственный обезьянам «Резус». В настоя­щее время Резус-фактор принято обозначать символами: Rh(D) или простоD. Позже обратили внимание на то, что женщины с группой 0 (I), родившие мертвый плод, при переливании им крови мужей 0 (I), как правило, дают типичную посттрансфузионную реакцию гемолитического типа. Исследования показали, что эти женщины отно­сились к резус-отрицательному типу и содержали в крови антитела «анти резус», которые вызывали гемолиз перели­вавшейся им совместимой в групповом отношении крови мужей. Было сделано заключение, что резус-отрицатель­ные женщины могут иммунизироваться эритроцитами их резус-положительного плода, унаследовавшего этот тип крови от резус-положительного отца. Приблизительно в это же время было установлено, что резус-отрицательные люди (мужчины и женщины) могут иммунизироваться резус-положительной кровью, причем способ введения ее в организм не имеет существенного значения.

Антитела против антигенов системы «Резус», в частности антитела анти Резус (антитела анти-D), возникают только в результате иммунизации при переливании резус-несовместимой крови (гемотрансфузий) или при беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом. При этом антигены или эритроциты плода проникают через плацентарный барьер в кровоток матери и вызывают сенсибилизацию ее организма, проявлением которой является выработка антител «анти Резус». При накоплении в опре­деленной концентрации, антитела анти-Dиз кровотока матери поступают в организм плода, фиксируются на его эритроцитах и разрушают (гемолизируют) их. В результа­те возникает так называемый «резус-конфликт» — част­ный случай биологического конфликта матери и плода, обусловленный резус-несовместимостью. Следует отме­тить, что биологический конфликт из-за несовместимости крови матери и плода по группам кровиAB0 (AB0-конфликт) встречается реже и протекает доброкачествен­нее. Чаще всего, он возникает в комбинации: мать — группа 0 (I) — плод — группа А (II). При этом групповые агглютинины (антитела анти А) разрушают эритроциты плода группы А(II).

Антитела «антирезус» сохраняются, как правило, пожизненно. Титр этих антител может снижаться, но при пов­торном контакте с антигеном (переливание резус-несовместимой крови или резус-несовместимая беременность) продуцирование их в сенсибилизированном организме резко возрастает.

В России используется двойное обозначение групп крови — 0(I), А(II), В(III) и AB(IV).

Принадлежность человека к той или иной группе крови не зависит от возраста, пола, расовой принадлежности. Группа крови передается по наследству в соответствии с законами генетики. Она является индивидуальной биологической особенностью человека, которая определяется уже в раннем периоде эмбрионального развития и не изменяется в течение всей последующей жизни.

Группа крови системы АВ0 — это определенное сочетание врожденных групповых антигенов эритроцитов, содержащихся в этих клетках крови, и антител к ним, находящихся в плазме (сыворотке).

Вещества, находящиеся в клетках крови, представляют собой антигены (агглютиногены), вызывающие агглютинацию (склеивание) клеток крови при встрече и взаимодействии с одноименными антителами плазмы, получившими название агглютининов. Агглютиногены клеток крови обозначаются латинскими буквами А и В, агглютинины — соответственно греческими буквами α (антитела «анти А») и β (антитела «анти В»). Это нашло отражение в буквенном обозначении групп крови.

Кровь любого человека может одновременно содержать только разноимённые друг другу агглютиногены и агглютинины или не иметь каких-то из них. В противном случае должна произойти агглютинация (склеивание) клеток крови.

В зависимости от сочетания агглютиногенов и агглютининов различают четыре группы крови по системе АВ0— основной и наиболее важной антигенной системе клеток крови человека.

В крови I группыимеется так называемый «нулевой» (0) агглютиноген, агглютиногены А и В отсутствуют. Соответственно в плазме (сыворотке) находятся оба агглютинина — α и β. Полная формула крови I группы — 0αβ(I).

В крови II группыимеются агглютиноген А и агглютинин β. Полная формула II группы крови — Аβ(II).

В крови III группыимеются агглютиноген В и агглютинин α. Полная формула III группы крови — Вα(III).

В крови IV группы имеются оба агглютиногена — А и В и отсутствуют агглютинины. Полная формула IV группы крови — AB₀(IV).

У 88 % людей с группой крови А(II) определяется разновидность агглютиногена А — А₁, а у 12% имеется агглютиноген А₂. Они отличаются друг от друга по силе агглютиногенной способности. Значительно сильнее она выражена у разновидности А₁. Соответственно, и группа крови AB(IV) также имеет две подгруппы: A₁B(IV) и A₂B(IV). Разделение на подгруппы имеет большое практическое значение при определении группы крови. Не зная этого, можно ошибочно определить группу крови 0(I) - вместо А(II), и В(III) - вместо AB(IV). Это связано с тем, что при наличии слабого агглютиногена А₂агглютинация при определении группы крови наступает поздно (иногда на 4 - 5 минуте) и выражена очень слабо.

Групповая принадлежность крови системы АВ0 определяется реак­цией агглютинациипри помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток или цоликлонов (моноклональных антител).

Для определения групп крови применяют иммунную реакцию – реакцию гемагглютинации. Реакция гемагглютинации - склеивание и выпадение в осадок, в виде комочков, эритроцитов (несущих антигены) под действием одноимённых антител сыворотки крови. Групповая агглютинация – специфическая агглютинация клеток, наступающая под действием антител, направленных к групповым антигенам этих клеток. Антигены, участвующие в реакции агглютинации называют агглютиногенами. Антитела, направленные против одноимённых антигенов эритроцитов и обладающие свойством их агглютинировать, называют гемагглютининами (гемагглютинирующими антителами).

Определение группы крови системы АВ0 возможно тремя способами

= При помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток.

= При помощи цоликлонов.

= Перекрёстным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток (или цоликлонов) и стандартных эритроцитов. При этом способе, так же как и при первых двух, определяют наличие или отсутствие эритроцитарных антигенов и, кроме того, врачи–лаборанты (в лаборатории) устанавливают наличие или отсутствие групповых антител в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных эритроцитов

Для проведения иммуносерологических исследований (определение групповой принадлежности крови системы АВ0, Резус – принадлежности, проведение проб на индивидуальную совместимость крови донора и сыворотки реципиента) используют кровь (эритроциты и сыворотку) реципиента не более двухдневного срока хранения при температуре +2⁰…+6⁰ (при условии отсутствия гемолиза в пробирке).

А. Определение группы крови стандартными изогемагглютинирующими сыворотками.

Стандартные сыворотки для определения групп крови изготавливаются учреждениями службы крови (отделе­ниями, станциями и институтами переливания крови). Они готовятся из сыворотки крови человека и содержат в различных комбинациях и в достаточном количестве груп­повые изоагглютинины α и β, которые вступают в реакцию антиген - антитело с антигенами системы АВ0 исследуе­мых эритроцитов, склеивая (агглютинируя) их.

В нашей стране при определении групп крови обяза­тельно использование стандартных сывороток четырех групп: 0 (I), А (II), В (III),AB(IV). Последняя не содержит групповых изоагглютининов и не должна давать реакции агглютинации (изосерологически нейтральна). Сыворотки окрашены и имеют в перечисленной последовательности следующую цветовую маркировку: бесцветная, синяя, красная, желтая. При нанесении стандартных сывороток на плоскость, где определяется группа крови, необходимо соблюдать такую же последовательность расположения цветов (контроль верности нанесения на плоскость стандартных сывороток). Стандартные сыворотки выпускают­ся учреждением-изготовителем в герметически закрытых флакончиках (как для инсулина) или ампулах. Этикетка на этих сосудах со стандартной сывороткой имеет надписи: наиме­нование учреждения, выпустившего сыворотку; групповая принадлежность данной сыворотки приведенным выше шифром - 0 (I),A(II) и т. д.; титр антител, количество (обычно по 2-5 мл) сыворотки, дата истечения срока годности; серия, обозначающая порядковый номер изгото­вления в текущем году. Помимо этого на этикетках нане­сены цветные полосы, число и цвет которых соответствуют обозначению групповой принадлежности сыворотки.

Например, сыворотка 0 (I) не окрашена и поэтому полос не имеет, сыворотка А (II) имеет две полосы синего цвета, сыворотка В (III) — три красные и АВ (IV) — четыре желтые полосы. Титром сыворотки считается ее максимальное разведение, при котором невооруженным глазом видна реакция агглютинации; его величина гарантируется учреждением — изготовителем сыворотки.

Определение групп крови производится в хорошо осве­щенном помещении при температуре +15 ... +25 "С.

Используются любые белые пластинки (тарелки, пластик) со смачиваемой поверхностью (на которых не растекаются капли сывороток) или специальные планшеты. На верхнем крае пишется фамилия и инициалы человека, у которого определяется группа крови. Специальные пластины имеют над лунками обозначения, согласно которым наносятся стандартные сыворотки. На приспособленных для определения группы крови пласти­нах по верхнему краю слева направо наносят надписи: О (I), А (II), В (III) и при необходимости - АВ (IV). Под соответствующими обозначениями в два ряда наносятся разные серии стандартных сывороток. В верхнем и нижнем рядах одногруппные сыворотки должны быть различных (не совпадающих) серий. То есть, используются по две серии сывороток каждой группы. Каждая сыворотка наносится отдельной пипеткой (чаще всего используют глазные пипетки), поэтому пипетки должны маркироваться (0, А, В, АВ) и нахо­диться только в своих флакончиках (ампулах). Для каждого флакончика сыворотки выделяется отдельная маркированная пипетка, которая после нанесения сыворотки на пластинку сразу же опускается в ту ампулу с сывороткой, из которой была взята. На плоскости, рядом с каплями стандартной сыворотки, палочкой (или уголком предметного стекла) наносятся капельки исследуе­мой крови; соотношение «сыворотка — кровь» должно быть 10:1. Ориентировочно капля стандартной сыворотки должна быть равна величине копеечной монеты, капелька крови — величине головки портняжной булавки (кровь для исследования может быть взята из пальца, вены, взвеси эритроцитов (со дна пробирки), из запаянной трубки контейнера с гемотрансфузионной средой.

Капля крови должна быть примерно в 10 раз меньше капли стандартной сыворотки (соотношение 1:10), с которой она смешивается сухой стеклянной палочкой (уголком предметного стекла). После размешивания капель в равномерно красный цвет пластинку покачивают, оставляют на 1 —2 мин в покое, а затем снова периодически покачивают. Не ранее чем через 3 мин в капли, в которых наступила агглютинация (невооружённым глазом видны «песчинки», «зёрнышки»), добавляют по 1 капле (0,05 мл) физиологического раствора NaCl. После внесения физиологического раствора ложная агглютинация исчезает, истинная — остается без изменения или усиливается. Хотя агглютинация начинается в течение первых 10 — 30 секунд, наблюдение следует продолжать до истечения 5 минут, после чего делается заключение о группе крови.

Реакция гемагглютинации может быть положительной (наличие агглютинации) или отрицательной (отсутствие агглютинации). Результаты в каплях с сыворотками двух разных серий одной и той же группы крови должны совпадать. Результаты определений могут дать четыре различные комбинации положительных и отрицательных реакций:

1) если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию, то исследуемая кровь принадлежит к группе 0(I);

2) если сыворотки групп 0αβ(I) и Вα(III) дали положительную реакцию, а сыворотка группы Аβ(II) — отрицательную, то исследуемая кровь принадлежит к группе А(II);

3) если сыворотки групп 0αβ(I) и Аβ(II) дали положительную реакцию, а сыворотка группы Вα(III) — отрицательную, то исследуемая кровь принадлежит к группе В(III);

4) если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, для исключения неспецифической агглютинации, необходимо провести дополнительное исследование с сывороткой (одной серии) AB0 (IV). Если реакция с этой сывороткой будет отрицательная, то исследуемая кровь действительно относится к группе AB(IV).

Оценка результатов определения групп крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток приведена в таблице:

Оценка результатов определения групп крови при помощи изогемагглютинирующих сывороток

Группа крови	Сыворотка 0αβ(I) - анти-А+B	Сыворотка Aβ (II) - анти-B	Сыворотка Bα (III) - анти-A	Сыворотка AB0 (IV)
0 (I)	-	-	-	-
А (II)	+	-	+	+
B (III)	+	+	-	+
AB (IV)	+	+	+	-

Знаком (+) обозначено наличие агглютинации, знаком (-) ее отсутствие.

Ошибки при определении групп крови системы АВОвозникают в результате нарушения инструкции.

Основные причины ошибок:

• нарушение порядка нанесения стандартных сыворо­ток, что может привести к неправильной трактовке полу­ченных результатов;

• изменение активности или специфичности сыворо­ток вследствие того, что при нанесении их на планшет из флакончиков (ампул) пользуются одной пипет­кой или смешивают капли сыворотки и крови одной стеклянной палочкой (одним уголком предметного стекла);

• снижение активности сывороток в результате наруше­ния режима хранения (необходима средняя температура хранения +4...+6 °С);

• потеря специфичности вследствие инфицирования или повышение вязкости сывороток от высыхания при хранении их в открытых флакончиках (ампулах);

• нарушение пропорции сыворотка — кровь (10:1);

• исключение из методики определения групп крови физиологического раствора или стандартной сыворотки АВ (IV) группы;

• преждевременный или, наоборот, поздний учет результатов определения групп крови (учет должен произ­водиться по истечении 5 мин с момента перемешивания капель).