Шпоры / 40

40. Процесс транскрипции на примере E. coli. Комплекс белков, участвующих в репликации. Инициация, элонгация и терминация транскрипции. РНК-полимеразы – сложные белки, состоящие из нес-х субъединиц. транскриптаза Е.coli –наиболее изученный белок с четвертичной структурой. Субъединичный состав фермента(5 субъединиц): (2^α),β,β̓ и W (конститутивные субъединицы, которые составляют основу кор-фермента. После присоединения σ(сигма) – фактора образуется - holo-фермент рнк-полимераза, который способен узнавать промоторную область в оперонах бактерий и инициировать транскрипцию. β субъед. уч-т в связывании полинуклеотидной цепи РНК, β’ осущ-т связывание ДНК, комплекс β’ и α служит для взаимодействия с промоторами- нуклеотидными последов-ми ДНК, детерминирующими инициацию транскрипции. инициация. инициация происходит в зоне промотора, кот содержит старт – синал. К кору присоединяется субъединица σ – фактора, образуется холо-фермент и «закрывает» 60 пар нуклеотидов. ДНК узнает промотор и инициирует процесс транс-ии. Как только произошла инициация транскрипции, σ-фактор отделяется. Элонгация - продолжение синтеза РНК, и терминация - его остановка, осуществляются core-ферментом. Элонгация. Продвигаясь вдоль ДНК, РНК-полимераза наращивает цепь РНК от 5 к 3 концу. транскрибируется только одна из цепей ДНК. Синтез РНК требует локального расплетения двуцепочечной цепи ДНК, для того чтобы РНК-полимераза получила доступ к азотистым основаниям матрицы. Раскручивает с помощью особого сайта, в структуре которого «цинковые пальцы». Во время раскручивания на короткое время образуется «открытый комплекс», внутри кот. РНК-ДНК спираль длиной около 20 нуклеотидов. Затем фермент вновь закручивает ДНК и готовая часть РНК-транскрипта выводится через особый канал. Терминация. Наращивание идет до тех пор пока РНК-полимераза не встретит специфическую послед-ть, которая Определяется последовательностью ДНК в зоне терминатора (стоп – сигнала). В стоп-сигнале имеется GC-богатый участок- полиндром. транскрипция в этом участке приводит к тому, что в образовавшемся РНК- транскрипте быстро образуется устойчивый эл-т – шпилька, которая нарушает прочность связывания ДНК-РНК и вытесняет РНК-полимеразу из комплекса. Транскрипция за ним олиго А последовательности(4-8 адениловых нуклеотида) ведет к образования непрочного уч-ка РНК-ДНК дуплекса, сост-го из олиго А-олигоУ пар, что так же ведет к разрушению связей м/у цепью ДНК и молекулой РНК. Белковый фактор терминации р (ро)-фактор, прикрепленный к РНК перед терминатором облегчает терминацию.после образования шпильки происходит высвобождения синтезированной РНК,отсоединение РНК-полимеразы и восстановление двуспиральной структуры ДНК.

41.Транскриптон. Оперон. Регуляторные последовательности, для транскрипции. Расположение энхансеров, сайленсеров, Прибнов-бокс, промотор, оператор, терминатор. Регуляция транскрипции у прокариот – негативная с помощью метаболитов и позитивная комплексом ССА-белок – сАМР. Транскриптон – единица транскрипции, уч-к ДНК на котором происходит транскрипция, ограничен промотором и терминатором. Промотор— последовательность ДНК, обеспечивающая посадку РНК-полимеразы. терминатор — участок ДНК, определяющий остановку транскрипции и конец синтеза иРНК. Существует система регуляции реализации информации в клетке, она связана с деятельностью регуляторных белков – активаторов и репрессоров транскрипции. Обычно это ферменты, кот осущ-т серии реакций (метаболитическим путем), ведущих к распаду или синтезу каких-л. соединений. Группа согласованно регулируемых генов, кодирующих эти ферменты – оперон. В состав каждого из них входят регуляторные области промотор(место присоед. РНК полимеразы) и оператор – уч-к оперона, к которому присоединяются белки репрессоры и активаторы транскрипции. У многих промоторов выявлены две консенсусные последовательности :5- TATATT-3 и 5 – ТТGACA-3 , которые принято обозначать на нематричной(смысловой) цепи ДНК, тк для транскрипции важно ориентация промотора(она определяет цепь, кот служит матрицей для синтеза РНК) и очевидно РНК ориентируется на эти последовательности для поиска точки начала транскрипции. 5- TATATT-3 – ТАТАбокс(прибнов) в честь открывателя. Энхансеры – активаторы, располагаются на 5-3 конце гена или входят в состав интронов. Сайленсеры – подавляют экспрессию.

Различают негативную и позитивную транскрипцию. одной из первых стала известна структура и механизм экспресии lac-оперона кишечной палочки. В состав оперона входят гены, необходимые для расщепления лактозы до глюкозы и галактозы. Z – кодирует β-галактозидазу, У - галактозидпермеазу, А – галактозидтрансацетилазу.

Негативная регуляция(жакоба и моно).В отсутствие в клетке лактозы lac-оперон выключен. Активный белок репрессор,кодируемый в моноцистронном oпероне (LacI) , не имеющем оператора, связан оператором lac-оперона. Поскольку оператор перекрывается с промотором, даже посадка РНК-полимеразы на промотор невозможна. Как только некоторое количество лактозы попадает в клетку, две молекулы субстрата (лактозы) взаимодействуют с белком - репрессором, изменяют его конформацию - и он теряет сродство к оператору. Тут же начинается транскрипция Laс-оперона и трансляция образующейся мРНК; три синтезируемых белка участвуют в утилизации лактозы. Когда вся лактоза переработана, очередная порция репрессора, свободного от лактозы, выключает Laс-оперон.

Позитивная регуляция: Lac-оперон, подчиняющийся схеме негативной индукции, имеет и позитивный контроль. Кот состоит в индукции транскрипции , достигаемой присоединением к промотору комплекса из ССА– белка(б. активатор катаболитических оперонов) и сАМР – универсального регулятора многих метабол. процессов. цАМФ(циклический) образуется из АТФ ферментом аденилатциклазой. Чем больше в клетке глюкозы, тем меньше цАМФ. Если нет глюкозы, то цАМФ соединяется с белком катаболической репрессии (ССА) и образуется комплекс ССА-цАМФ, активирующий посадку РНК-полимеразы на промотор и способен многократно(50раз) усиливать транскрипцию. В присутствии лактозы Laс-оперон включается и работает. Если же в клетке есть еще и глюкоза (более экономичный источнок энергии), то нет цАМФ - и активатор не образуется, Lac-оперон работает "вяло", без дополнительной индукции.

42. Процессинг РНК. Сплайсинг, кэпирование, полиаденилирование.

Процессинг (созревание, процесс постранскрипционной модификации первичных транскриптов,необходим для образования зрелых рРНК,тРНК,мРНК) рРНК и тРНК у эукариот принципиально не отличается от такового у прокариот. Процессинг мРНК отличается сильно, наиболее изучен и представляет собой тонкоорганизованный процесс, влияющий на регуляцию экспресии генетического материала. состоит из нескольких этапов.

1. Сплайсинг 2. Кепирование 5’ конца. 3. Полиаденилирование 3 конца. Сплайсингу подвергаются только полиаденилированные мРНК.

1.Сплайсинг процесс при котором удаляются участки, не кодирующие белок (интроны) и сшиваются кодирующие аминокислотную последовательность участки — экзоны. Таким образом, незрелая пре-мРНК превращается в зрелую мРНК, с которой считываются (транслируются) белки клетки.

2.Кепирование - надевание "шапочки". Образование на 5 конце мРНК особой структуры – кэпа."Сар" представляет собой метилированный ГТФ (Гуанозинтрифосфат), присоединенный в необычной позиции 5'-5' и две метилированные рибозы в первых двух нуклеотидах мРНК. Назначение "Сар" 1. Защита 5'-конца мРНК от действия экзонуклеаз.

2.За счет узнавания "Сар"-связывающими белками происходит правильная установка мРНК на рибосоме.

3. Полиаденилирование .осуществляется ферментом поли А полимеразой и приводит к образованию на 3’ конце олиго А фрагмента, состоящий из 100-200 остатков адениловой кислоты. Каждый вид мРНК имеет "поли-А хвост" определенной длины. Он защищает 3'-конец от гидролиза, т.к. покрыт полиА-связывающими белками. В значительной степени время жизни мРНКв клетке и стабильность определяется длиной полиА-хвоста.

Процессинг у про и эукариот: прокариоты отличаются минимальным геномом, в его структуре нет вставок. У них к мРНК присоединяются рибосомы, трансляция до стоп-кодонов и образуются разные белки. У эукариот основные стадии процессинга протекают в ядре и в цитоплазму поступает зрелая матричная РНК.

43. Аутосплайсинг. Рибозимы. Минизимы. Использование рибозимов в практике. открыт Томасом Чеком (США) в 1982 году. Он работал с инфузорией Tetrаchymenа thermophyla. У ряда видов примитивных эукариот гены рРНК содержат особые интроны, для которых характерен уникальный механизм сплайсинга.(Сплайсинг процесс при котором удаляются участки, не кодирующие белок (интроны) и сшиваются кодирующие аминокислотную последовательность участки — экзоны.) Изучение 26S рРНК тетрахимеры привело к открытию сплайсинга осущ-го, без участия дополнительных соединений белковой природы и получившего название аутосплайсинг. из этой про-рРНК вырезается внутренний участок длиной в 414 нуклеотида. Два экзона сшиваются с образованием 26S рРНК. Единственное требование - определенная концентрация ионов магния. Была открыта каталитическая функция РНК и началось изучение РНК-ферментов – рибозимов.

Впервые было показано, что каталитической активностью обладают не только белки. Детальные исследования послужили стимулом для синтеза рибозимов заданного строения. Стало известно что кат. активн-ю обладают не только крупные РНК()более 400 нукл), но и короткие 13-20 членные олигонуклеотиды – минизимы. Работы с рибозимами направлены на поиск РНК-катализаторов способных ускорять деструкцию, но и могли сшивать молекулы РНК и их фрагменты. Специально сконструированные рибозимы, способны расщеплять РНК ВИЧ 1, что открывает возможность создания новых препаратов. Но в организме человека синтетические рибозимы могут быстро расщепляться. Решение этой задачи ученые так же пытаются найти путем различных модификаций.

.

44.Процессинг мРНК у эукариот. Участие мяРНК. Сплайсингосомы. Посстранскрипционные модификации пре-мРНК, особенно существенны для эукариот, что связано с мозаичным строением их генов, содержащих интроны. Число интронов может достигать нескольких десятков, что обуславливает наличие четкой системы слайсинга, в котором задействованы РНК особого вида – малые ядерные РНК(последовательности из 65-1000 нуклеотидов). Они присутствуют в ядрах в комплексах с белками(малые рибонуклеопротеиновые частицы мяРНП), стабильным компонентом котрого является фибрилларин – очень консервативный белок. Вообщем структура иРНК высококонсервативна. комплекс из множества мяРНП, который катализирует сплайсинг ядерных про—мРНК, носит название сплайсингосомы. мяРНП собираются в сплайсингосомы в определенной последовательности, мутации в этих последовательностях ведут к нарушению сплайсинга. Например, у человека в генах глобина человека ведет к анемии. Взаимодействие разных мяРНК в составе сплайсингосомы, со сплайсируемой пре – мРНК в 5’ и 3’ сайтах сообщает интрону петлеобразную структуру. На концах интронов находятся характерные повторности, их узнают разные семейсива мяРНК,при образовании сплайсингосом происходит конформация. Резкое изменение и сближение участков интрона, затем вырезание их , и сшивка экзонов.

Сближение экзонов создает условие для атаки 5’ конца интрона адениловым нуклеотидом, расположенным вблизи 3’ конца. В результате фосфодиэфирная связь разрывается между экзоном и 5’ концом интрона,происходит атака и в интроне образуется петля типа «лассо». После чего освобождается 3’ конец, выщепляет интрон и соединяется с экзоном образует зрелую молекулу мРНК.

45.Альтернативный сплайсинг – способ получения различных белков на базе одного гена. дефференциация путей созревания мРНК- альт.сплайсинг. несколько интронов могут сшиваться в разных комбинациях с образованием различных матричных последовательностей. Впервые был открыт у аденовирусов. Позволяет синтезировать разные по структуре и свойствам белки на базе одного гена. Существует три пути альт.сплайсиннга: 1. Используются разные промоторы для образования мРНК, вследствии получаются транскриптоны разной длины и разное кол-во экзонов, разные домены и полифункциональные белки. 2. Изменение сайта полиаденилирования первичного транскрипта = к изменению размеров и структуры 3-концевого участка пре-мРНК. 3. Выбор из одинаковых пре-мРНК различных экзонов, вырезание и сшивание в разных комбинациях. – способы регуляции активности генов. –возникают изоморфы белков, наборы различаются в тканях и органах.пример: семейсво белков цитоскелета нервных волокон,молекул Ig и тд.

46.Трансляция – синтез белков на основе матричной мРНК и основные молекулярные структуры, участвующие в процессе. Белковые факторы трансляции. трансляция(биосинтез белка) – процесс в результате кот информация, закодированная в первичной структуре нукл. кислот переводится последовательность ами.кислот синтезируемого белка. Перевод осуществляется в соответствии с правилами генетического кода. В ней уч-т три главных класса РНК: т,м,иРНК,рибосомы, белковые факторы тр-ии, IF факторы инициации, EF факторы элонгации, RF факторы терминации.

мРНК является информационной матрицей; тРНК “подносят” аминокислоты и узнают кодоны мРНК; рРНК вместе с белками образуют рибосомы, которые удерживают мРНК, тРНК и белок и осуществляют синтез полипептидной цепи. Процесс трансляции основывается на том, что каждому триплету мРНК (кодону) соответствует определенная аминокислота. Генетический код расшифровывают (реализуют) тРНК. тРНК имеет структуру, состоящую из четырех петель. К одной из них присоединяется аминокислота (акцепторная петля), в противоположной (антикодоновой) находится триплет нуклеоти-дов, комплементарный кодону мРНК. Этот триплет называют антикодоном.

47. Строение рибосом. Роль РНК и белков. Роль видов РНК, входящих в рибосомы, в синтезе белка. Рибонуклеиновые частицы локадизованы в циоплазме, митохондриях,хлоропластах. Рибосомы про и эукариот схожи по строению и функциям. Рибосома состоит из 3х субъединиц: малая(30-40s субъед.) служит для связывания мРНК и тРНК. Большая 50-60s субъединица уч-т в образовании пептидной связи. 5,8S субъед . рибосомы состоят из рРНК(каркас)+рибос. белки.с помощью сканерной микроскопии был изучена морфологи субчастиц и смоделирована их структура. Выделена спецеальная область – канал , к которому присоединяется матричная РНК по комплементарному принципу. Функция рибосом заключается в узнавании трёхбуквенных (трехнуклеотидных) кодонов мРНК, сопоставлении им соответствующих антикодонов тРНК, несущих аминокислоты, и присоединении этих аминокислот к растущей белковой цепи. Двигаясь вдоль молекулы мРНК, рибосома синтезирует белок в соответствии с информацией, заложенной в молекуле мРНК.

Для узнавания аминокислот в клетке имеются специальные «адаптеры», молекулы транспортной РНК (тРНК). Эти молекулы, имеющие форму клеверного листа, имеют участок (антикодон), комплементарный кодону мРНК, а также другой участок, к которому присоединяется аминокислота, соответствующая этому кодону. Присоединение аминокислот к тРНК осуществляется в энерго-зависимой реакции ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами, а получившаяся молекула называется аминоацил-тРНК. Таким образом, специфичность трансляции определяется взаимодействием между кодоном мРНК и антикодоном тРНК, а также специфичностью аминоацил-тРНК-синтетаз, присоединяющих аминокислоты строго к соответствующим им тРНК

48. Активация аминокислот, присоединение к т-РНК. Ферменты АРСазы Инициация трансляции на примере прокариот. Перед началом трансляции синтезированные в результате разнообразных биохимических реакции или полученные с пищей аминокислоты должны пройти стадию активации и присоединиться к тРНК, которе осуществляют их доставку к рибосомам. процесс активации аминокислот осуществляется в две стадии. Сначала аминокислота связывается с ферментом и реагирует с АТФ, образуя макроэргические связи. Затем аминоацильный остаток переносится на концевую 3'-ОН-группу концевого остатка рибозы тРНК. аминоацил-тРНК истинный субстрат для синтеза белка. Присоединение АК к тРНК осуществляют аминоацил-тРНК – синтетазы(АРС-азы). Они обладают высокой субстратной спецефичностью и активируют только белковые АК L-ряда и присоединяют их к имеющей определенный антикодон тРНК, поэтому их называю кодазы,шифразы. Также они могут образовывать комплексы вместе с ферментами(кот регулируют их активность путем фосфорилирования и, метилирования и т.д) – кодосомы.

Для начала трансляции необходимо взаимодействие субъединиц рибосомы, мРНК, инициатора аминоацил- тРНК и IF факторов. Синтез белка в большинстве случаев начинается с AUG-кодона, кодирующего метионин. Этот кодон обычно называют стартовым или инициаторным. Инициация трансляции предусматривает узнавание рибосомой этого кодона и привлечение инициаторной аминоацил-тРНК. Для инициации трансляции необходимо наличие пурин-богатых нуклеотидных последовательностей в районе стартового кодона (последовательность Шайна — Дальгарно, на расстроянии 3-10 нуклеотидов перед АУГ). Существование последовательности, отличающей стартовый AUG от внутренних совершенно необходимо, так как в противном случае инициация синтеза белка происходила бы хаотично на всех AUG-кодонах. На 2 стадии происходит присоединение 30S субчастицы к мРНК, при этом инициаторная формил-метионин-тРНК присоединяется в месте старт-кодона в комплексе с IF 3 и 1 факторами, которые влияют на конформацию 30S субчастицы. После образования комплекса белковые факторы покидают 30 субчастицу, и присоединяется 50 субчастица.и становится полная 70 S рибосома.формируется два центра связывания тРНК: Р-центра(пептидил) и А-центра(аминоацил).

49. Элонгация цепи. Транслокация. Терминация. Особенности трансляции у эукариот. элонгация пептида происходит в соответсвии с послеовательностью кодонов в направлении 5-3 конца,участвуют центры рибосомы Р и А. для элонгации необходимы аминоацил и три белковых фактора EF: EF-Tu, EF-Ts, EF-G. Реакция транспептидирования обеспечивает синтез пептидной связи в молекуле синтезируемого белка с участием активированных аминоацил-тРНК. Пептидная связь образется м/у СООН-группой растущей цепи и свободной NH2 группой следующей аминоацил тРНК. СООН конец остается в активированной форме, связан макроэргическими связями с тРНК. В каждой реакции макроэргич связи разрываются и тут же замещаются такой же связью, следующего АК-остатка.

Транслокация. Стадия элонгации.Перемещение рибосомы. Пептидил тРНК перемещается из А в Р центр рибосомы, одновременно передвигается МРНК на кодон. Протекает с участием фактора EF-G за счет гидролиза ГТФ. Происходит в результате взаимодействия субчастиц рибосом – размыкания и смыкания при участии стержня большой субчастицы.

Терминация рибосома достигает терминирующего кодона RF факторы связываются со стоп-кодонами мРНК. RF 1 – УАГ или УАА. RF 2 – УАА или УГА. RF 3 – вспомогательная роль. В случае моноцистронных мРНК эукариот – биосинтез белка заканчивается. В случае полицистронных мРНК прокариот рибосома может продолжить движение дойти до инициирующего кодона, начнется новый полный цикл трансляции: инициация, элонгация, терминация. Трансляция может стартовать не с первого инициирующего кодона(со 2,3), поэтому на одной мРНК могут синтезироваться матричные белки. Весь синтез белка среднего размера примерно 20 сек.

Трансляция у эукариот.этапы у эукариот и прокариот схожи, но у эукариот сложнее. Зрелые мРНК эукариот имеют на 5 конце КЕП – необходимые для связывание с малой (40с) субчастицей. Качастве стартового сигнала используется ближайший к 5 концу мРНК триплет АУГ, он должен находится в составе последовательности NNN A(G) NN AUG GNNN, где N-пиримидиновый нуклеотид. Рибосома сканирует мРНК последовательность, находит нужную(выше) и садится на неё.