2. Суперпродуцент - это биообъект промышленного использования.

• Как можно получить его и какими свойствами он должен обладать в отличие от природного штамма культуры?

Ответ

Современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, - это биологический организм-суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма по нескольким показателям.

1. безвредность для потребителя и обслуживающего персонала.

2. генетическая однородность и стабильность в отношении к субстратам и условиям культивирования.

3. высокий выход целевого продукта

4. способность расти на относительно дешевых питательных средах

5. благоприятные реологические свойства биомассы, обеспечивающие относительно несложное выделение продукта

6. устойчивость к фагам

7. благоприятные экологические показатели процесса (низкое спорообразование, запах и т.д.)

8. Отсутствие токсических веществ в целевом продукте и промышленных стоках.

Изменение биообъекта, благоприятное для его использования в производстве, должно передаваться по наследству и, соответственно, вызываться мутацией. На биохимическом уровне мутация — изменение первичной структуры ДНК в конкретном ее участке, что, в конечном счете, приводит к изменению фенотипа биообъекта. Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных — у прокариот, митохондриальных и плазмидных — у эукариот). Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Разброс по степени выраженности признаков обычно невелик. Совершенствование биообъектов путем предварительного мутагенеза и последующей селекции оказалось гораздо более действенным. Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае, как правило, это ультрафиолетовые, гамма-, рентгеновские лучи; во втором — нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, некоторые природные вещества (например, из ДНК-тропных антибиотиков вследствие их токсичности не применяемых в клинике инфекционных заболеваний).Механизма активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними). Подразумевается, естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Последующей задачей является отбор и оценка именно нужных биотехнологу мутаций. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка. В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Продуцент целевого вещества, наиболее перспективный в практическом отношении, может многократно обрабатываться разными мутагенами. Новые мутантные штаммы, получаемые в научных лабораториях разных стран мира, служат предметом обмена при творческом сотрудничестве, лицензионной продажи и т.п. Одним из самых блестящих примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами — штаммами (штамм — клоновая культура, однородность которой по определенным признакам поддерживается отбором) грибаPenicilliumchrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940-х гг. в течение нескольких десятилетий во многих лабораториях. Вначале некоторый успех был достигнут при отборе мутантов, появившихся в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В результате ряда удачных мутаций и ступенчатого отбора все более продуктивных мутантов активность штаммов сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А.Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина. Производственные штаммы крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении: Совершенствование биообъектов применительно к производству не исчерпывается только повышением их продуктивности. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов. Из всего изложенного следует, что современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, — это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям. Хранение таких штаммов-суперпродуцентов представляет серьезную самостоятельную проблему. В случае применения высших растений и животных в качестве биообъектов для получения лекарственных средств возможности использования мутагенеза и селекции для их совершенствования ограничены.

Совершенствование биообъектов методами мутации и селекции

На биохимическом уровне мутация - изменение первичной структуры ДНК организма и, как следствие, изменение фенотипа биообъекта. Изменение биообъекта, благоприятное для его использования в производстве (мутация), должно передаваться по наследству.

Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных - у прокариот, митохондриальных и плазмидных - у эукариот).

Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Совершенствование биообъектов путем мутаций и последующей селекции оказалось гораздо более действенным.

Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае это ультрафиолетовые, гамма-, рентгеновские лучи; во втором - нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, антибиотики, специфично взаимодействующие с ДНК (их обычно не используют в терапии).

Механизм действия как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным влиянием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними). Повреждения не должны приводить к летальному исходу. Последующей задачей является отбор (селекция) нужных биотехнологу мутаций. Эта часть работы в целом весьма трудоемка.

В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Продуцент целевого вещества, наиболее перспективный в практическом отношении, может многократно обрабатываться разными мутагенами. Новые мутантные штаммы, получаемые в научных лабораториях разных стран мира, служат предметом обмена при творческом сотрудничестве, лицензионной продажи и т.п.

Одним из примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами - штаммами гриба Penicillium chrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940-х гг. в течение нескольких десятилетий во многих лабораториях. Вначале проводили отбор в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В настоящее время активность штаммов сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А. Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина.

Производственные штаммы крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении.

Совершенствование биообъектов не исчерпывается только повышением их продуктивности. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов.

Таким образом, современный биообъект, используемый в биотехнологическом производстве, - это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям.

В случае применения высших растений и животных в качестве биообъектов для получения лекарственных средств возможности использования мутагенеза и селекции для их совершенствования ограничены.

Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии

Клеточная инженерия - «насильственный» обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. В результате создаются неприродные биообъекты, среди которых могут быть отобраны продуценты новых веществ или организмы с ценными в практическом отношении свойствами.

С помощью клеточной инженерии возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами. Культуры таких клеток обладают новыми свойствами. В качестве примера можно привести получение «гибридных» антибиотиков.

Известно, что среди актиномицетов есть принадлежащие к разным видам продуценты антибиотиков гликозидной структуры с варьирующими агликонами и сахарами. Так, антибиотик эритромицин имеет 14-членный макроциклический агликон и два сахара (дезозамин и кладинозу), присоединенных к нему гликозидной связью, а у антибиотиков - антрациклинов агликон состоит из четырех сконденсированных углеродных шестичленных колец, соединенных с аминосахаром.

С помощью клеточной инженерии были получены продуценты таких антибиотиков, у которых макролидный агликон эритромицина был связан с углеводной частью, соответствующей антрациклинам, и наоборот, антрациклиновый агликон с сахарами, свойственными эритромицину.

Создание биообъектов методами генетической инженерии

Генетическая инженерия – это методы получения рекомбинантных ДНК, объединяющих последовательности различного происхождения.

Гены, кодирующие белки человека, вводятся в геном одноклеточных (E.coli, Corynebacterium,Saccharomycescerevisiaeи др.). В результате микробные клетки синтезируют соединения, специфичные для человека - белковые гормоны, белковые факторы неспецифического иммунитета (инсулин, соматотропин, интерфероны, факторы свертывания крови, лактоферрини т.д.)

Основные этапы генетической инженерии

1) Получение ДНК (химический синтез, из мРНК, обработка ДНК рестриктазой)

2) Линеаризация вектора для клонирования той же рестриктазой

3) Смешивание ДНК и разрезанного вектора

4) Трансформация сшитыми молекулами вектора клеток-хозяев

5) Размножение клеток-хозяев, амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках

6) Получение белкового продукта

Таким образом, генетическая инженерия позволяет создавать биологически активные вещества человека вне его организма.

3. На фармацевтической фабрике полученный препарат « Адонизид» был подвергнут стандартизации согласно НД. Предложите показатели качества, характеризующие данный препарат в соответствии с источниками и способами получения:

Охарактеризуйте химическое строение действующих веществ, входящих в препарат «Адонизид».

Приведите комплекс испытаний, позволяющих достоверно определять действующие вещества в препарате. Напишите уравнения реакций.

Ответ

АДОНИЗИД ( Аdonisidum ). Новогаленовый препарат из травы горицвета весеннего. Прозрачная, слегка желтоватого цвета жидкость, своеобразного запаха, горького вкуса. В 1 мл содержит 23 - 27 ЛЕД или 2,7 - 3,5 КЕД (Большее содержание ЛЕД и КЕД сравнительно с препаратами наперстянки объясняется относительно малой стойкостью гликозидов горицвета в организме.). Применяют при хронической недостаточности кровообращения I и II степени, вегетативных неврозах.

Сердечные гликозиды — это группа физиологически активных веществ при­родного происхождения, в весьма ма­лых дозах оказывающие специфическое действие на сердечную мышцу.

Применение - для ком­пенсации недостаточности сердечной деятельности, многие из них оказывают и диуретический эффект, относятся к спис­ку А.

Сахара (циклические ацетали), где сахарная часть и несахарная (агликон) соединены через полуацетальный гидроксил сахарной час­ти

Несахарная часть гликозидов называется агликоном; агликоны стероидной природы (в сердечных гликозидах) носят также назва­ние генины.

Сырье сушат при 40—60 °С или помещают в сосуд с парами спирта, хлороформа — это способствует инактивации ферментов, а глико­зиды остаются нерасщепленными.

Строение сердечных гликозидов.

Все агликоны содержат ненасыщенное лактонное кольцо. Агликоны сердечных гликозидов содержат 23 или 24 углеродных атома и различаются между собой по степени окисленности. Они со­держат не менее 2 гидроксильных групп, некоторые — альдегидную.

Сердечные гликозиды по характеру заместителя в 10-м положении можно разделить на 2 группы:

1. подгруппа наперстянки - в положении С₁₀ содержит -СН₃ группу;

2. подгруппа в положении С ₁₀ содержит альдегидную строфанную группу.

Вторичные гликозиды наперстянок состоят из агликонов и са­харной части одинаковой у всех 3 строфатозида вторичных гликозидов.

Физические свойства сердечных гликозидов Сердечные гликозиды - это твердые, кристалличес­кие, плохо растворимы в воде, оптически активные вещества.

Методы идентификации.

Анализ сахаров.Сахара, дают реакции на углеводы:. Специфическими сахарами сердечных гли­козидов являются 2,6-дезоксисахара, для обнаружения которых применяют тест Келлера—Киллиани с антроном. Методика основа­на на образовании фурфурола или его производных из сахарных компонентов под действием концентрированной H₂SO₄. Фурфурол с антроном затем дает продукт конденсации, окрашенный в зеле­ный или сине-зеленый цвет:

2. Анализ стероидного цикла

Реакции стероидного цикла Фриделя—Крафтса. При нагревании до 100°С гликозиды в уксусном ангидриде с 20—25 % раство­ром треххлористой сурьмы дают лиловое окрашивание.

Тест Либермана—Бурхарда. Раствор испытуемого вещества в ук­сусной кислоте смешивают с 2 мл смеси, состоящей из 50 частей уксусного ангидрида и 1 части концентрированной H₂SO₄; при этом развивается розовое окрашивание, постепенно переходящее в зеле­ное или синее. строфан­тин и его гликозиды в этих условиях окрашиваются в оливково-зеленый цвет, переходящий в желтый.

Для сердечных гликозидов характерно явление галохромии: об­разование окрашенных соединений с концентрированными мине­ ральными кислотами; наибольшее распространение получили цвет­ные реакции с серной кислотой.

3. Реакции на β,α-ненасыщенное лактонное кольцо

1. Сердечные гликозиды в присутствии щелочи дают с пикриновой кислотой (тринитрофенолом) оранжевую окраску (реакция Балье):

Пятичленный лактонный цикл можно также обнаружить по образованию окрашенных в красно-фиолетовый цвет продуктов взаимодействия в щеточной среде с м-динитробензолом р-я Раймонда.

Методы количественного определения

До настоящего времени количественная оценка кардиоактивных стероидов проводится в основном с помощью биологических тес­тов на животных.Основаны на способности карденолидов вызывать в токсических дозах остановку сердца животных в стадию систолы. Их активность оценивают по сравнению с активностью стандарт­ных препаратов и выражают в единицах действия (ЕД) — кошачих (КЕД), лягушачих (ЛЕД), голубиных (ГЕД).

Химические методы. Кислотно-основное титрование в неводной среде (подгруппа строфанта).

Физико-химические методы. УФ-спектрофотометрический (исполь-зуется при анализе сырья и стандартного вещества при 217—219 нм).

1. Фотометрический метод:

а) с 2,4-динитрофенилсульфоном — рекомендуется для анализа сырья, лекарственных веществ и лекарственных пре­паратов (ГФ XI) (реакция на пятичленное лактонное кольцо).

3. Хроматографические методы (ВЭЖХ, ГЖХ).

4. Флюориметрические методы анализа.

Испытание на чистоту. Чистота характеризуется различными физико-химическими параметрами (удельное вращение, ИК- и УФ-спектры, Тпл), регламентируется содержание влаги (способствует гидролизу полуацетальной связи), сульфатной золы и тяжелых металлов (фак­торы, катализирующие окисление препаратов). Для оценки добро­качественности инъекционных растворов дополнительно оценива­ют их прозрачность и цветность.

Хранение. Список А. В хорошо укупоренных банках оранжевого стекла, в сухом, защищенном от света месте