ГОСы Все предметы / Биотехнология / 3-6 выделение ферментов

3.6. Приведите методы выделения и очистки ферментов в биотехнологическом производстве.

Выделение и очистка ферментов – трудоёмкий и дорогой процесс.

Ферменты, растворённые в цитоплазме клеток, легко экстрагируются из них водой или разбавленными растворами солей. Затем эти ферменты очищают и отделяют друг от друга, фракционируя сульфатом аммония.

Ферменты связанные со структурными элементами клеток, можно выделить только после разрушения клеточной оболочки – дезинтеграции. Клетки можно разрушить механически – растирая, замораживая и оттаивая, подвергая действию ультразвука, или же ферментативно, используя специальные ферментные препараты. Для разрушения клеток биомассу промывают 0,1 м раствором сахарозы рН 7,3 , содержащий какой либо буфер, ЭДТА, и альбумин. Затем добавляют стеклянные микрошарики и гомогенизируют в дезинтеграторе 1-2 минуты при 13000 об/мин. Клеточные стенки и стеклянные шарики отделяют центрифугированием.

Если фермент содержится в липопротеидных комплексах, не растворимых в воде, тогда при помощи бутилового спирта извлекают липиды. Фермент остаётся в водном слое, а липиды переходят в слой бутилового спирта.

Концентрирование растворов ферментов достигают, избавляясь прежде всего от балластных белков. Если фермент термостабилен, то от белков освобождаются нагреванием раствора. Осадок отделяют центрифугированием. Иногда от белков освобождаются денатурируя их кислотами или воздействием на ферментный раствор хлороформом.

После частичного удаления балластных белков для последующего концентрирования фермента используют фракционирование растворами солей, например, сульфата аммония. Осадок отделяют центрифугированием и после лиофилизации надосадочной жидкости получают ферментный препарат.

Для коагуляции белков и очистки фермента используют также органические растворители – ацетон, этиловый спирт, метиловый спирт, диоксан.

Перспективным методом очистки ферментов является селективная адсорбция, при использовании каолина, трифосфата кальция, гидроокиси алюминия и др. адсорбентов которые небольшими порциями добавляются к ферментному раствору. Для элюирования фермента из адсорбента используют фосфатный буфер.

Дальнейшую очистку ферментного препарата, содержащего в небольших количествах примеси белков, сходных по физико-химическим свойствам с ферментом, ведут методом ионообменной хроматографии. Белки в ионообменном процессе взаимодействуют с ионитом и при помощи электростатического взаимодействия связываются с его поверхностью. Для элюирования белков с поверхности ионита используют изменение концентрации при рН пропускаемого через ионит буфера или введение нейтральных солей (натрия или калия хлоридов).

В последнее время для разделения ферментов широко используются иониты на основе целлюлозы.

Для окончательного фракционирования белков используют также электрофорез, в основе которого лежит разделение кислых и основных молекул белков по их заряду в электрическом поле. Ферменты при достаточной степени очистки можно получить и в кристаллическом виде. Кристаллизацию ферментов проводят из растворов сульфата аммония, спирта или органических растворителей. К концентрированному раствору фермента осторожно по каплям добавляют насыщенный раствор сульфата аммония или спирт до появления едва заметной мути. Затем раствор на несколько дней оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы отделяют и ведут перекристаллизацию до тех пор, пока продолжается увеличение активности фермента.

Концентрирование жидких ферментных растворов и получение сухих препаратов ферментов проводят методом лиофильной сушки в вакууме. Раствор быстро замораживают в жидком азоте и проводят сублимационную сушку в вакууме. Такие лиофильно высушенные препараты достаточно стабильны.