ГОСы Все предметы / Биотехнология / 20.6.совершенствование биообъектов

20.5. Совершенствование биообъектов как источников ЛС включает несколько направлений. Определите эти направления в соответствии с целевыми задачами.

Современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, — это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма по нескольким показателям.

1. высокий выход целевого продукта

2) способность расти на относительно дешевых питательных средах

3) благоприятные реологические свойства биомассы, обеспечивающие относительно несложное выделение продукта

4) устойчивость к фагам

5) благоприятные экологические показатели процесса (низкое спорообразование, запах и т.д.)

Методы совершенствования биообъектов

Мутации. Изменение биообъекта, благоприятное для его использования в производстве, должно передаваться по наследству и, соответственно, вызываться мутацией. На биохимическом уровне мутация — изменение первичной структуры ДНК в конкретном ее участке, что, в конечном счете, приводит к изменению фенотипа биообъекта.

Долгое время понятие мутации относили только к хромосомам у прокариот и хромосомам (ядру) у эукариот. В настоящее время кроме хромосомных мутаций появилось также понятие мутаций цитоплазматических (плазмидных — у прокариот, митохондриальных и плазмидных — у эукариот).

Спонтанные мутации встречаются, как правило, довольно редко. Разброс по степени выраженности признаков обычно невелик. Совершенствование биообъектов путем предварительного мутагенеза и последующей селекции оказалось гораздо более действенным.

Мутагенез осуществляется при обработке биообъекта физическими или химическими мутагенами. В первом случае, как правило, это ультрафиолетовые, гамма-, рентгеновские лучи; во втором — нитрозометилмочевина, нитрозогуанидин, акридиновые красители, некоторые природные вещества (например, из ДНК-тропных антибиотиков вследствие их токсичности не применяемых в клинике инфекционных заболеваний).

Механизма активности как физических, так и химических мутагенов связан с их непосредственным действием на ДНК (прежде всего на азотистые основания ДНК, что выражается в сшивках, димеризации, алкилировании последних, интеркаляции между ними).

Подразумевается, естественно, что повреждения не приводят к летальному исходу. Последующей задачей является отбор и оценка именно нужных биотехнологу мутаций. Эта селекционная часть работы в целом весьма трудоемка.

В первую очередь биотехнолога интересуют мутантные культуры, обладающие повышенной способностью к образованию целевого продукта. Потенциальные возможности мутагенеза (с последующей селекцией) обусловлены зависимостью биосинтеза целевого продукта от многих метаболических процессов в организме продуцента. Весьма эффективный путь увеличения образования целевого продукта — нарушение системы ретроингибирования.

Повысить активность продуцента можно также, изменив (за счет мутаций) систему транспорта предшественников целевого продукта в клетку.

Наконец, иногда целевой продукт при резком увеличении его образования отрицательно влияет на жизнеспособность собственного продуцента (так называемый суицидный эффект). Повышение резистентности продуцента к образуемому им же веществу часто необходимо для получения, например, суперпродуцентов антибиотиков.

Одним из самых блестящих примеров эффективности мутагенеза с последующей селекцией по признаку увеличения образования целевого продукта является история создания современных суперпродуцентов пенициллина. Работа с исходными биообъектами — штаммами (штамм — клоновая культура, однородность которой по определенным признакам поддерживается отбором) гриба Penicillium chrysogenum, выделенными из природных источников, велась с 1940-х гг. в течение нескольких десятилетий во многих лабораториях. Вначале некоторый успех был достигнут при отборе мутантов, появившихся в результате спонтанных мутаций. Затем перешли к индуцированию мутаций физическими и химическими мутагенами. В результате ряда удачных мутаций и ступенчатого отбора все более продуктивных мутантов активность штаммов сейчас в 100 тыс. раз выше, чем у обнаруженного А.Флемингом исходного штамма, с которого и началась история открытия пенициллина.

Производственные штаммы крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значения не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении:

Совершенствование биообъектов применительно к производству не исчерпывается только повышением их продуктивности. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных использовать более дешевые и менее дефицитные питательные среды. Большое значение в отношении гарантии надежности производства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов.

Из всего изложенного следует, что современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, — это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штамма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям. Хранение таких штаммов-суперпродуцентов представляет серьезную самостоятельную проблему.

В случае применения высших растений и животных в качестве биообъектов для получения лекарственных средств возможности использования мутагенеза и селекции для их совершенствования ограничены.

Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии

Клеточная инженерия — «насильственный» обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. В результате создаются неприродные биообъекты, среди которых могут быть отобраны продуценты новых веществ или организмы с ценными в практическом отношении свойствами.

Перспективы клеточной инженерии заключаются прежде всего в том, что с ее помощью возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами.

Первый этап работы связан с удалением у микроорганизмов клеточной стенки.

Пептидогликан клеточной стенки может быть расщеплен с помощью ферментов (гидролаз пептидогликана), из которых самым известным является лизоцим,

Удалить клеточную стенку и в тоже время сохранить целостность мембраны протопласта можно, лишь выровняв осмотическое давление внутри клетки и в среде.

При протопластировании: для получения протопластов клеточную стенку удаляют ферментативной обработкой в «гипертонической» среде с 20 % раствором сахарозы или маннита, иногда с 10 % раствором натрия хлорида в зависимости от определенных особенностей биообъекта и преследуемых целей.

Если биообъект принадлежит к микроскопическим (плесневым и дрожжевым) грибам, то для получения протопластов используют, как правило, не лизоцим, а комплексный ферментный препарат, выделенный из пищеварительного тракта виноградной улитки. Связано это с тем, что состав клеточной стенки у грибов более сложен, чем у бактерий.

Следующий этап работы состоит в объединении суспензий двух образцов протопластов, принадлежащих разным штаммам или разным видам, в более редких случаях — даже разным родам. Частота слияния резко повышается при добавлении к протопластам полиэтиленгликоля, обладающего свойствами детергента.

Культуры таких клеток обладают новыми свойствами. В качестве примера можно привести получение «гибридных» антибиотиков.

Известно, что среди актиномицетов есть принадлежащие к разным видам продуценты антибиотиков гликозидной структуры с варьирующими агликонами и сахарами. Так, антибиотик эритромицин имеет 14-членный макроциклический агликон и два сахара (дезозамин и кладинозу), присоединенных к нему гликозидной связью, а у антибиотиков — антрациклинов агликон состоит из четырех сконденсированных углеродных шестичленных колец, соединенных с аминосахаром.

С помощью клеточной инженерии были получены продуценты таких антибиотиков, у которых макролидный агликон эритромицина был связан с углеводной частью, соответствующей антрациклинам, и наоборот, антрациклиновый агликон с сахарами,

свойственными эритромицину.

Создание биообъектов методами генетической инженерии

Генетическая инженерия гораздо конкретнее и точнее клеточной по характеристике используемых объектов и оперирует в основном с разными по форме и размерам фрагментами клетки.

Генетическая инженерия - соединение фрагментов ДНК природного и синтетического происхождения или их комбинацию с последующим введением полученных рекомбинантных структур в живую клетку для того, чтобы введенный фрагмент ДНК после включения его в

хромосому либо реплицировался, либо автономно экспрессировался.

Основные этапы генетической инженерии

1) Получение ДНК (химический синтез, из мРНК, обработка ДНК рестриктазой)

2) Линеаризация вектора для клонирования той же рестриктазой

3) Смешивание ДНК и разрезанного вектора

4) Трансформация сшитыми молекулами вектора клеток-хозяев

5) Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках

6) Получение белкового продукта