ГОСы Все предметы / Биотехнология / 22-6 Производство ферментов

22.6. Производство ферментов имеет определенную специфику их получения с помощью биотехнологии. Определите эту специфику в соответствии со свойствами самих ферментов.

Культивирование микроорганизмов - продуцентов ферментов целесообразно в средах строго детерминированного состава, обеспечивающих направленный биосинтез нужного Ф.

Синтез многих Ф репрессируется легкоусвояемыми источниками углерода (глюкозой, фруктозой, маннозой и др.); этот эффект носит название катаболитной репрессии (иногда глюкозньм эффектом). Катаболитной репрессии подвержен биосинтез таких Ф, как -амилаза, целлюлаза, глюкоамидаза, инвертаза и др.

Ферменты, катализирующие превращение азотсодержащих субстратов, также регулируются по механизму катаболитной репрессии; их биосинтез репрессируется ионами аммония или быстроусвояемыми аминокислотами. Аминокислоты в анаэробных условиях культивирования инициируют биосинтез соответствующих декарбоксилаз. При наличии в среде большой концентрации мочевины стимулируется биосинтез уреазы. Введение в среду культивирования аргинина индуцирует биосинтез аргиназы. Источниками органического азота могут служить пептон, триптон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина или любая их смесь.

Наличие в среде культивирования различных биополимеров обусловливает одновременное накопление комплекса протеаз, амилаз, нуклеаз, липаз.

На рост микроорганизмов и биосинтез Ф существенное влияние оказывают ионы кальция, марганца, цинка и др. Ионы железа и магния активируют и стабилизируют протеолитические ферменты. Присутствие ионов железа и меди в среде культивирования существенно для биосинтеза железо- и медьсодержащих Ф, участвующих, как правило, в окислительно-восстановительных реакциях (утилизации и превращения энергии). Отсутствие таких ионов может негативно отразиться на скорости многих метаболических процессов и на биосинтезе Ф, катализирующих эти процессы.

Продуценты Ф, относящиеся к строгим анаэробам, требуют полностью бескислородных условий культивирования и очень богатых, полноценных сред. Процесс культивирования в этом случае можно проводить в более простых ферментерах, так как не нужна аэрация и перемешивание.

Оптимизация питательных сред и условий культивирования для обеспечения направленного биосинтеза продуцентом целевого продукта является важным этапом разработки биотехнологического процесса получения высокоочищенных Ф. Преимущественный биосинтез культурой нужного продукта с минимальным содержанием посторонних белков позволяет в дальнейшем существенно упростить выделение и очистку Ф.

Переработка культуральной жидкости

Большинство Ф промышленного производства относится к внеклеточным, поэтому они находятся в культуральной жидкости. При выделении внутриклеточных Ф (изоферментов) основной задачей является сбор клеток, содержащих Ф.

Глубинная культура представляет собой суспензию, содержащую остатки питательных веществ, продукты метаболизма (в том числе внеклеточные Ф), взвешенные клетки продуцента. В период культивирования обычно происходит ограниченный лизис микробных клеток и в суспензии появляется неконтролируемое количество внутриклеточных метаболитов. Из этой достаточно сложной и многокомпонентной смеси приходится выделять и очищать один Ф.

Технологический процесс начинают с разделения растворимых и нерастворимых веществ, концентрирования и фракционирования, заканчивают разнообразными способами хроматографической очистки.

Фильтрация жидкости, содержащей мелкодисперсный клеточный материал, частично разрушенные клетки и внутриклеточные полимеры, сопряжена с определенными трудностями. Фильтруемый раствор вязок, склонен к гелеобразованию, осадок сжимается и закупоривает поры фильтра. Для избежания этого применяют крупнопористые фильтрующие материалы - диатомиты, кизельгур, бентонит, фильтроперлит и др.

Сепарацию клеточной массы и сопутствующих конгломератов осуществляют с помощью центрифуг

Дезинтеграция биомассы. Основное количество Ф обычно находится внутри клеток, где он образует комплексы с другими биополимерами. Клеточные структуры могут быть разрушены в результате прямого механического воздействия (баллистическими, УЗ-, экструзионными, ферментативными методами - см. гл. 5.7). После дезинтеграции биомассы продуцента фермента получается вязкая, опалесцирующая суспензия, содержащая фрагменты клеточных стенок, субклеточных структур и продукты их деградации, а также самые разнообразные высоко- и низкомолекулярные органические вещества.

Если ферменты мембраносвязанные, необходимо экстрагировать их. Наиболее часто используемым экстрагентом для ферментов используют водные буферные растворы. Если ферменты находятся в растворенном состоянии, на одной из первой стадий обработки клеточного гомогената должны быть удалены нерастворимые частицы. Для этого применяют скоростное центрифугирование. Образуется прозрачный клеточный экстракт, содержащий только растворенные биополимеры и низкомолекулярные компоненты. Среди нежелательных процессов, которые могут происходить в таком растворе – протеолиз собственными клеточными протеазами.

Инактивацию протеаз осуществляют обработкой клеточного экстракта специфическими ингибиторами-комплексонами (ЭДТА, о-фенантролин, оксихинолин), солями ртути или серебра. Денатурацию нуклеиновых кислот в процессе очистки Ф обусловливает низкая ионная сила или основность среды. Можно использовать специальные осадители, образующие с нуклеиновыми кислотами нерастворимые комплексы. С этой целью применяют бромистый цетилтриметиламмоний, стрептомицинсульфат, протаминосульфат, полиэтиленимин.

Фракционирование белков растворителями. Обычно для фракционирования растворов Ф применяют этанол и ацетон. При повышенной температуре (более 4 °С) в водно-органических смесях Ф денатурируют, поэтому работы с органическими растворителями проводят при низких температурах. Органический растворитель охлаждают до (-30) - (-40 °С) сухим льдом или жидким азотом; температура смеси поддерживается при этом на уровне от -10 до -20 °С. Осадок центрифугируют, затем растворяют в небольшом объеме буферного раствора, удаляя следы органических растворителей диализом или ультрафильтрацией через гель.

Тонкие методы очистки ферментов

Для более эффективной очистки ферментов используют ионнообменную, аффинную хроматографию и гель-фильтрацию. Наиболее эффективная очистка Ф достигается ионно-обменной хроматографией с использованием сорбентов на основе сополимеров метакриловой кислоты и различных гидрофобных мономеров. В препаративной энзимологии применяют иониты на основе натуральных или полусинтетических полисахаридных матриц (ионно-обменные целлюлозы). Среди многих производных целлюлозы чаще используют ДЭАЭ-, ТЭАЭ-, КМ- и фосфоцеллюлозы (первые два - аниониты, последние - катиониты). Предпочтительна гранулированная целлюлоза, гидродинамические свойства которой позволяют проводить хроматографический процесс с большой скоростью.

Фракционирование смесей Ф, имеющих различный размер молекул, проводят гель-фильтрацией на разных типах сефадексов - модифицированных производных- линейного полисахарида полидекстрана. Для фракционирования крупномолекулярных смесей применяют поперечносшитые акриламиды под названием ультрагелей и агарозу в поперечно-сшитом состоянии (сёфарозы СЬ 2В, 4В и 6В). В поперечно-сшитых агарозах хроматографический процесс можно осуществить в широком интервале рН и температуры, использовать буферные растворы, содержащие органические растворители, соли.

Наряду с Натуральными и полусинтетическими полисахаридными матрицами для гель-фильтрации используют синтетические поликриламидные гели. Большое количество аминогрупп в их структуре придает полимеру гидрофобные свойства, хорошую набухаемость в воде с образовании пористой структуры геля.

Для гель-хроматографии, в отличие от других методов хроматографического разделения белков, не требуется обессоливать пробу, корректировать рН, не нужны специальные элюирующие буферы. Смесь белков, продвигаясь по сорбенту, освобождается от солей и распределяется в порядке уменьшения м.м. Белки и другие компоненты смеси с сорбентом не взаимодействуют. Из колонки вначале выходят самые крупные молекулы, затем - меньшими м.м. и, наконец, соли.

Аффинная хроматография характеризуется высокими выходом и степенью очистки выделяемого .белка. Основа этого биоспецифического метода состоит в том, что в многокомпонентной смеси между одним или несколькими белками-ферментами и полимерными сорбентами образуется стабильная связь, в результате чего эти белки из раствора переходят на нерастворимый сорбент. Чем меньше белков связывает сорбент, тем выше его селективность (идеальная селективность - связывание одного Ф). Центром связывания служат субстраты, их аналоги, обратимые ингибиторы, коферменты, антитела и другие вещества, называемые лигандами, присоединенные к матрицам. Лиганды специфически взаимодействуют с активными центрами выделяемого Ф. В качестве лигандов используют синтетические аналоги субстратов или коферментов.

Строгая специфичность аффинного сорбента к выделяемому Ф значительно улучшает сам - хроматографический процесс, состоящий из последовательно сменяющихся этапов сорбции, удаления несорбированных белков и элюирования сорбированного Ф. Условия сорбции подбираются таким образом, чтобы выделяемый Ф сорбировался наиболее полно, а сопутствующие белки не задерживались. Это зависит от рН, ионной силы, природы буферных растворов, температуры. После отмывки сорбента от несорбированных белков резко изменяется Один или нескольких из указанных параметров, в результате разрушается комплекс фермента с сорбентом и Ф высвобождается. Элюирование Ф проводят, добавляя в элюент специфически взаимодействующие с ферментом вещества - субстраты, коферменты, растворимые ингибиторы.

Как правило, это повышает эффективность очистки, так как специфические агенты не разрушают неспецифические комплексы между сорбентом и сопутствующими белками.